Ш щ дифференциация: Упражнения на дифференциацию звуков Ш-Щ. (речевой материал)

Содержание

Дифференциация букв ш-щ | Методическая разработка (5 класс):

Методическая разработка урока по дисграфии на почве несформированности языкового анализа и синтеза, сочетающейся с оптической дисграфией

Артамонова Ольга Викторовна                                                                               Учитель-логопед школы 401                                                              Колпинского района СПб                                                                                                [email protected]

Аннотация. Методическая разработка урока по дифференциации букв  Ш-Щ. Используя данный материал,  учащиеся смогут закрепить навык дифференциации букв Ш-Щ на письме, обогатить словарный запас, развить навыки связной речи.

Ключевые слова: методическая разработка, логопедическое занятие, дифференциация ш-щ, дисграфия.

Конспект логопедического занятия: «Дифференциация букв ш-щ».

Логопедическая тема: «Дифференциация букв ш-щ».

Грамматическая тема: «Согласование прилагательных с существительными»

Цель: Закрепление знаний о буквах ш-щ. Учить дифференцировать буквы.

Задачи:    

Коррекционные:                                                                                                                     1.Учить сравнивать буквы ш-щ.                                                                                   2. Уточнять, обогащать лексику по теме урока.                                                                                                                                           3. Развивать зрительное внимание и зрительную память.                                                                             4. Развивать мелкую моторику и координацию.                                                       5.Профилактика аграмматизмов.                                                                                                           6. Развивать связную речь.

Образовательные:                                                                                                     1.Развивать умение выделять ударные гласные.                                                                                                                                                           2.Развивать навык согласования прилагательных с существительными в роде, числе, падеже.                                                                                                                                                                                    3.Развивать навыки чтения.                                                                                                                   4.Развивать чувство языка.

Воспитательные:                                                                                           1.Воспитывать интерес к учёбе.                                                                                                       2. Воспитывать усидчивость, внимание, самоконтроль, умение действовать по инструкции.

Оборудование: доска, распечатки, раздаточный материал, тетради, ручки, цветные карандаши.

Ход урока

Отгадайте загадки.

В этом заведении        

Все перебывали.

Двоечники, гении

Отметки получали.

Учились здесь артисты,

Певцы, артиллеристы.

Сюда хожу и я,

И вы, мои друзья.   (школа)  Какой первый звук в слове? Дайте характеристику.                                                                                                                  Ответ записать зашифровать.  Ш подчеркнуть.

Вроде ёжика на вид,                                                                                                                  Но не просит пищи. 
По одежде пробежит— 
И одежда станет чище. (щётка) Какой первый звук в слове? Дайте характеристику.

Назовите тему сегодняшнего урока.     (Дифференциация букв ш-щ)  

По первым звукам угадайте слово

1.шишка,  очки, конфета, огонь, люстра, альбом, дом       –     шоколад            Подберите однокоренные слова (шоколадка, шоколадный)

2. щука, енот, коробка, алфавит       – щека                                                                                    (щёчка)

Запишите слова в три столбика, вставьте пропущенные буквы ш-щ.

Про__ение, ка__ель, кры__а,  __утка, стра__или___е, ро__а, каранда__, но__а, ко__ка, свя___енный, кре__ение, сла__е, слу__ать, е__ё, __кольный,  мы__ка, и__у, за__ито, __екотно, __ит, __алун,  ни__ий, пло__адь, закра__у.

Физминутка. Нос-пол-потолок.

Прочитай шифр и напиши слова.

А

Б

В

Г

1

мы

шов

ще

шун

2

руш

кор

за

ку

3

гол

ви

нок

ка

4

куш

вальд

шнеп

ка

В1В3 –     щенок                                             В1А3 –   щегол                                                              Б2 ,Г1 – коршун                                              В2, Б3, А2,  Г4  –    завирушка                                                                                        Г2,А4,Г3  – кукушка                                       Б4,  В4  –  вальдшнеп                                                Г4, А1,Б2, Г3-камышовка                                                            

завирушка – очень мелкая особь, не больше воробья.

Найдите лишнее слово (щенок)

Составьте слова из данных слогов.

Та, за, щи            ка, ту, шён            ние,  го, у, ще,             ви, проз,ще

Ший, хо, ро        тать, ко, ще            ный,  душ                   щик, гуль, про

Вставить пропущенные буквы ш-щ.    Соедините слова из правого столбика со словами из левого.                                                                                                                                                                                                  ово__ные                           мы__и                                                                                  __умные                             __и                                                                                  хи__ная                            поме__ение                                                                                           __ерстяные                      ро__а                                                                                боль__у__ее                     ве___и                                                                            обе___ать                        уго___ение                                                                    __ур__а__ие                       __еглы                                                                                                                                                                                                    цвету__ая                         __ука

Ответ                                                                                                                         овощные                          щи                                                                                           большущее                       помещение                                                                                                                                 хищная                             щука                                                                                             шерстяные                        вещи                                                                                               обещать                            угощение                                                                                                                                                                                                                                                                            щуршащие                       мыши                                                                                                                       цветущая                          роща                                                                                                                 шумные                           щеглы    

Списать текст, исправляя ошибки.

Весна

Вот и прищла весна. Солнышко показывается чаше. Ешё на прощлой неделе лежал снег, а сейчас на проталинах видна зеленеюшая трава. Скоро зашумят ручьи. В лесу уже слышно шебетание птиц: «Прошай, зима!»

Итог. О чём мы говорили сегодня на уроке?                                                                             Если урок вам понравился, закрасьте кружок зелёным цветом, если вы сделали несколько ошибок, но сами их заметили- жёлтым, а если продолжаете путать ш-щ, то красным цветом.

Конспект логопедического занятия по теме “«Дифференциация букв Ш – Щ».

Тема: «Дифференциация букв Ш – Щ».

Цель: дифференциация букв Ш – Щ в словах и предложениях.

Задачи:

Коррекционно-образовательные:

– закрепить зрительный образ букв Ш – Щ, учить различать на письме;

– учить конструировать буквы Ш, Щ;

– формировать умения дифференцировать звуки Ш – Щ в словах и предложениях;

Коррекционно-развивающие:

– развивать фонематическое восприятие, зрительно-пространственное представление;

– развивать конструктивную деятельность;

– развивать умение составлять предложения;

– развивать общую и мелкую моторику.

Коррекционно-воспитательные:

– формировать навык самоконтроля, положительной учебной мотивации;

Оборудование: предметные картинки со звуками Ш, Щ; элементы букв Ш, Щ на каждого ученика; карточки с заданиями.

Ход занятия

I.  Вводная часть.

1.     Эмоциональный настрой.

Логопед:

Кто хочет разговаривать,

Тот дожжен выговаривать

Все правильно и внятно,

Чтоб всем было понятно!

2.Логопедическая зарядка.

-упражнения на дыхание;

-артикуляционная зарядка;

-чистоговорки.

2.  Сообщение темы.

На столах карточки.

Логопед: Сядет тот, кто найдет правильно написанное слово на карточке. Ответы детей…

Логопед: Какие похожие буквы есть в этих словах?

Ответы детей: Буквы Ш и Щ.

Логопед: значит, о каких буквах и звуках мы сегодня будем говорить?

(после ответа детей педагог на доску выставляются буквы Ш и Щ).

II. Основная часть.

1.Сказка «Буквы – путешественницы».

Когда-то давным-давно жили в алфавите две буквы-близнецы. И звали их одинаково: «ш», и стояли они рядышком. А буквы «щ» тогда вообще не было. Однажды решили буквы отправиться в путешествие на воздушных шариках. Когда они перелетали через широкую реку, шарик у одной из букв лопнул, и она упала в воду. Подплыла к ней хищная рыба и стала тянуть за крючок. Тянула-тянула, пока не вытянула петельку. Буква от испуга стала другую песенку петь – не ш-ш-ш, а щ-щ-щ. А рыба стех пор стала называться «щука». На берегу в это время стояли две буквы «а» и «я». Попросила их буква «щ» помочь выбраться на берег. Буква «я» сказала: «Нет, вода холодная, боюсь ножки замочить». Буква «а» смело вошла в реку и вытащила «щ» на берег. С тех пор буква «щ» не дружит с «я», даже рядом никогда не становится. Решили буквы «ш», «щ», «а» построить вдоль реки заборчик, чтобы хищная рыба близко не подплывала. Заборчик получился такой: ша, ща, ша, ща…

2.  Работа с элементами букв Ш, Щ.

Логопед: Чем похожи и чем отличаются буквы Ш и Щ? Ответы детей…

Логопед: Выложите из элементов буквы, которые пишутся в словах: шина, щит, щука, шум, бабушка.

Дети выкладывают буквы.

3.  Дифференциация в словах. Работа в тетрадях.

Логопед: Внимание на доску. На одной строке запишите слова, в которых есть буква Ш, а на следующей строке запишите слова с буквой Щ. Подчеркните букву Ш одной чертой, а букву Щ двумя чертами.

Малыш, щетка, шахтер, вещь, плащ, шапка.

4. Зрительная гимнастика.

Вот окошко распахнулось                 Широко открывают глаза.

Кошка вышла на карниз.                   Часто моргают глазами.

Посмотрела кошка вверх.                 Смотрят вверх.

Посмотрела кошка вниз.                   Смотрят вниз.

Вот налево повернулась.                  Смотрят влево.

Проводила взглядом мух.                 Взглядом проводят «мух» от левого 

                                                                  Плеча к правому.

И уселась на карниз.                          Дети приседают.

Глаза быстро отвела,

Посмотрела на кота.                          Смотрят прямо.

И закрыла их руками.                        Закрывают глаза руками.

5.  Дифференциация в предложениях. Работа по индивидуальным карточкам.

Логопед: Составьте предложения, изменяя слова по смыслу. Получившиеся предложения запишите в тетрадь. Подчеркните букву Ш одной чертой, а букву Щ двумя чертами.

Щенок, звать, Шарик.

Кошка, у, красивый, ушки.

Щенок, из, пить, плошки.

6.  Динамическая пауза.

Имитация движений в воздухе.

Пальцы сжали в кулачок,

Карандаш зажали.

А теперь, давай, дружок,

Разогни два пальца.

И подумай не спеша,

Что за буква? Ясно – «Ш».

7.  Дифференциация в тексте. Работа с доской.

Логопед: Читайте по одному предложению, вставляя пропущенные буквы Ш или Щ.

_енка поместили в поме_ении, в передней,между _кафом и боль_им я_иком, положили Ми_ино _ерстяное пальто. Постелька вы_ла теплая.

Логопед: Запишите слова с пропущенными буквами в тетрадь.

8. Работа по индивидуальным карточкам.

Логопед: Исправьте допущенные ошибки на карточках. Запишите исправленные слова в тетрадь. Прочитайте, что у вас получилось.

Кощелек, роша, шесть, плаш, плошадь, лощадь.

III.  Подведение итогов.

Логопед: О каких буквах мы сегодня говорили?

Расскажите, что у каждого из вас получилось лучше всего, а что еще осталось непонятным, в чем нужна помощь?

Вот разрешением ваших проблем мы и займемся с вами на следующем занятии. А сегодня всем спасибо за работу.

Дифференциация Ш – Щ | Тренажёр на тему:

Дифференциация Ш – Щ.

  1. Задание: «Прочитай слова, вставляя пропущенные буквы «Ш» или «Щ».

Обе_ать, _аг, _айба, _апка, пи_ать, мы_ата, у_анка, ре_ать,уго_ать, вра_ать, ды_ать, ме_ать, тре_ать, про_ать, _ахматы, лап_а, _арф, поме_ать, обра_ать, до_атый, возвра_ать, восхи_ать.

И_у, ме_ок, пи_у, _ум, _ут, _уба, та_у, уго_у, _утка, ми_ень, о_ейник, поме_у, тре_у, _ука, _упать, _ёки, _ётка, _каф, _таб, _ёлкать, за_ёлка, _мель, _ тука, _кола, сгу_ённый.

  1. Задание: «Вставь пропущенные буквы».

Т___В___Р______ – синоним слова «друг».

Л___Н________И – весенние цветы белого цвета.

Р___________А – она бывает берёзовой.

___АХ_____Т___ – настольная игра.

СВ___Р______К – профессия.

_____П____ВН____К – колючий кустарник.

О____Й_____К – надевают на шею собаке.

____ЁТ_____ – ей чистят одежду, обувь.

М_______НЬ – в неё нужно попасть.

____УК____ – рыба.

К___М_____И – они растут у реки.

Р_________НИЕ – это есть у задачи.

У____ЕЛЬ___ – низина между отвесными склонами гор.

____Л___П___А – небольшая лодка.

П__М____Н___К – тот, кто оказывает помощь.

____Т____РВ___Л – руль на корабле.

___ЕГ___Л – птица.

___Н___Р___К – его завязывают (обувь).

_____Н____К – детёныш собаки.

  1. Задание: «Допиши, если нужно, недостающий элемент буквы Щ».

На помошь Ване пришёл товариш. Луна освешает рошу. В озере большие леши. Прилетели в рошу красношекие шеглы. Мы наловили ершей и лешей. Птичка верешала, думать мне мешала. Миша и Паша играли со шенком. Тётя Даша угошала Машу. Мне нужны шипцы. Шелестит листва, и шебечут птицы. Берёзовая роша.

  1. Задание: «Вставь в слова нужный слог».

ЩА – ША

Гу___ – ту ___                                пи___ть –  ли ___ть

Ча ___ – ча___                                тре___ть – ре___ть

Ро___ – поро___                             ___вель – ___лфей

Поме___ть – поме___ть               обе___ть – ме___ть

Наве___ть – ве___ть                     укро___ть – укра___ть.

ЩЁ – ШЁ

____лк – ___лк                               ___тка – ___рстка

___ки – ___пот                               мо___ный – га___ный.

ЩУ – ШУ

Пи___ – пи___                                поме___ – спе___

Про___ – про___                           уго___ – уку___.

ЩИ – ШИ

Пи___ – пи___                               ле___ – ер___

Тре___ – ре___                               пла___ – на___

За___та – за___та                           ве___ – ва___.

ЩЕ – ШЕ

___пка – ___йка                              пу___ – ти___

___бет – ___лест                             вра___ние – ре___ние

И ___т – пи___т

Задание: «Вставь подходящее по смыслу слово».

Суши мокрые ________________.

У Даши болит ________________.

Мы наловили ершей и __________.

На ______________ шумит народ.

Шелестит листва, и __________________ птицы.

Под ___________________ в тиши ходят важные лещи.

Слова для справок: площади, щека, щебечут, вещи, лещей, кувшинками.

Воробей

Я возвращался с охоты и шёл по_______________.  Собака бежала впереди. Вдруг она уменьшила _________ и стала красться.

Впереди сидел молодой___________________.  Он беспомощно растопырил едва прораставшие ___________________. Вдруг, сорвавшись с дерева, старый воробей упал перед собакой. Он _________________ своё детище. Каким громадным _____________ должна была ему казаться собака! Он ___________ и дрожал от страха. И всё-таки он не усидел на ветке…

 Я поспешил отозвать ________________________ пса и ушёл. Я восхищался героизмом маленькой ______________.

                                                                                (По И.С. Тургеневу.)

Слова для справок: защищал, роще, пищал, пташки, чудовищем, воробышек, шаги, крылышки, смущенного.

Тема №39. Звуки [Ш] – [Щ]. Буквы Ш – Щ – 13 Января 2014

Коррекционно-развивающие задачи.

Учить ребенка внимательно вслушиваться в речь взрослого, различать на слух правильное и неправильное употребление родовых окончаний прилагательных.

Учить слухо-произносительной дифференциации звуков [Щ] — [Ш].

Совершенствовать навыки аналитико-синтетической деятельности.

Учить ребенка анализировать простые предложения с предлогом, составлять схемы.

Задание 1. Дидактическое упражнение «Правильно ли это?». Взрослый читает ребенку предложения, а ребенок внимательно слушает и говорит, правильно это или нет.

Дорогой друг. Родной дочь Дорогая друг. Родная дочь. Высокое небо. Золотой кольцо. Высокий небо. Голубая небо. Большой город. Золотая кольцо. Большая город. Большое город.

Задание 2. Дифференциация звуков [Ш] — [Щ]. Дидактическое упражнение «Составь слово (взрослый произносит слова по слогам), назови первый звук в слове»:

шах, ма, тист; щу, паль, цы.

Сравнить артикуляцию звуков [Ш] и [Щ] (найти общее и различие), вспомнить характеристику звуков [Ш] и [Щ], обозначение.

Задание 3. Дидактическое упражнение «Хлопни в ладошки, если услышишь звук [Ш]»:

ш, щ, щ…; ша, ща…; ащ, аш…; шапка, щенок, щегол, машина…

Дидактическое упражнение «Скажи наоборот»:

ша-ща, шу-…; ащ-аш, ощ…

Повторить за взрослым серию слогов:

ша-ша-ща, ща-ша-ша, ща-ша-ща, ша-ща-ша, ша-ща-ща, ща-ща-ша.

Закончить слово нужным звуком ([Ш] — [Щ]):

каранда…, ле…, ово…, ду…

Задание 4. Разложить картинки на две стопки: предметы, в названии которых есть звук [Ш], и предметы, в названии которых есть звук [Щ].

Вспомнить как можно больше слов со звуками [Ш] и [Щ], разделить слова на слоги, придумать с каждым словом предложение.

Заменить звук [Ш] на звук [Щ] в словах. Какие слова получились? Составить с каждой парой слов предложение:

чаша — чаща, шелк — …, пишу — …, пиши — …, прошу — …

Вспомнить загадки, чистоговорки со звуками [Ш] и [Щ] (см. темы № 30, 37).

Задание 5. Дифференциация букв Ш — Щ.

Вспомнить буквы, которыми обозначаются на письме звуки [Ш] и [Щ], найти в них общее и различие.

Конструирование и реконструкция букв с помощью счетных палочек.

Игры с буквами.

Задание 6. Преобразование слов с помощью букв разрезной азбуки:

чаша — чаща; пиши — пищи, пишу — пищу.

Анализ предложения (напомнить ребенку, что имена всегда пишутся с прописной буквы). Составление схемы предложения. Объяснить ребенку, что предлог — от самостоятельное слово в предложении и выделяется в схеме отдельно. Определение количества и порядка слов в предложении. Нахождение предлога и определение его места в предложении. Запись предложения под диктовку, чтение.

У Шуры щука.


Дифференциация звуков и букв Ш-Щ

1. Дифференциация звуков и букв Ш-Щ

Задачи
• коррекционные:
1)уточнение произношения звуков;
2)закрепить навык различия звуков [ш-щ] в слогах, словах;
3)развитие зрительного гнозиса и тонких дифференцировок
движений руки;
4)нахождение родственных слов в стихотворении.
• здоровьесберегающие:
содействовать сохранению и укреплению здоровья
обучающихся;
• воспитательные:
формировать положительную учебную мотивацию.

2. К нам пришёл Гном из страны Звуков и Букв

Гном просит вас
послушать загадки,
отгадать их.
А также назвать
первый звук в первой
отгадке!
Во второй загадке
надо назвать последний
звук.

3. Первая загадка

У нее во рту пила.
Под водой она жила.
Всех пугала, всех глотала.
А теперь – и к нам попала.

4. Первая отгадка – щука

щ

5. Вторая загадка

Драчун и забияка,
Живет в воде,
Кости на спине
– И щука не проглотит!

6. Вторая отгадка – ёрш

ш

7. Посмотрим в зеркала

Губы – круглые
Язык – поднят вверх
Воздушная струя – теплая, идет
вверх
Горлышко – не работает

8. Посмотрим в зеркала

Губы – круглые
Язык – поднят вверх
Воздушная струя – теплая, идет
вверх толчками
Горлышко – не работает

9. Сравним звуки

Ш
Губы – круглые
Язык – поднят вверх
Воздушная струя – теплая,
идет вверх
Горлышко – не работает
Звук глухой.
Всегда твердый!
Щ
Губы – круглые
Язык – поднят вверх
Воздушная струя – теплая,
идет вверх толчками
Горлышко – не работает
Звук – глухой.
Всегда мягкий!

10. Скороговорка

Наварила щука щей,
Пригласила трех ершей.
Говорили всем ерши:

11. Буква ш состоит из:

12. Буква щ состоит из:

13. Сравним буквы ш и щ:

Из
Из
Состоит буква
Состоит буква
ш
щ

14. Найди буквы Ш и Щ!!!

16. Прочитайте слоги: – строчками – столбиками

АШ – ША ОШ – ОЩ УШ – УЩ
ША – ЩА ШО – ЩО ШУ – ЩУ
ИШ – ИЩ ЕШ – ЕЩ ЁШ – ЁЩ
ШИ – ЩИ ШЕ – ЩЕ ШЁ – ЩЁ
ЁРШ
ЛЕЩ
корюшка
ПОДЛЕЩИК
пикша
горбуша
ЩУКА

18. Рыбалка

19. Стихотворение про рыбу

У РЫБЫ рыбья чешуя
И рыбьи плавники.
Нырнула вглубь рыбка моя,
Прощайте, рыбаки!
Звук Ш – всегда твердый!
Звук Щ – всегда мягкий!
Буква Ш состоит из трех
крючков!
Буква Щ состоит из трех
крючков и петельки!
Все молодцы!!!

Дифференциация звуков и букв Ш-Щ — презентация на Slide-Share.ru 🎓

1

Первый слайд презентации: Дифференциация звуков и букв Ш-Щ

Задачи коррекционные: 1) уточнение произношения звуков; 2)закрепить навык различия звуков [ш-щ] в слогах, словах; 3)развитие зрительного гнозиса и тонких дифференцировок движений руки; 4)нахождение родственных слов в стихотворении. здоровьесберегающие: содействовать сохранению и укреплению здоровья обучающихся; воспитательные: формировать положительную учебную мотивацию.

Изображение слайда

2

Слайд 2: К нам пришёл Гном из страны Звуков и Букв

Сегодня мы с вами пойдем на рыбалку! Гном просит вас послушать загадки, отгадать их. А также назвать первый звук в первой отгадке! Во второй загадке надо назвать последний звук.

Изображение слайда

3

Слайд 3: Первая загадка

У нее во рту пила. Под водой она жила. Всех пугала, всех глотала. А теперь – и к нам попала.

Изображение слайда

4

Слайд 4: Первая отгадка – щука

щ

Изображение слайда

5

Слайд 5: Вторая загадка

Драчун и забияка, Живет в воде, Кости на спине – И щука не проглотит!

Изображение слайда

6

Слайд 6: Вторая отгадка – ёрш

ш

Изображение слайда

7

Слайд 7: Посмотрим в зеркала

Губы – круглые Язык – поднят вверх Воздушная струя – теплая, идет вверх Горлышко – не работает

Изображение слайда

8

Слайд 8: Посмотрим в зеркала

Губы – круглые Язык – поднят вверх Воздушная струя – теплая, идет вверх толчками Горлышко – не работает

Изображение слайда

9

Слайд 9: Сравним звуки

Ш Губы – круглые Язык – поднят вверх Воздушная струя – теплая, идет вверх Горлышко – не работает Звук глухой. Всегда твердый! Щ Губы – круглые Язык – поднят вверх Воздушная струя – теплая, идет вверх толчками Горлышко – не работает Звук – глухой. Всегда мягкий!

Изображение слайда

10

Слайд 10: Скороговорка

Наварила щука щей, Пригласила трех ершей. Говорили всем ерши: – Щи у щуки хороши!

Изображение слайда

11

Слайд 11: Буква ш состоит из:

Изображение слайда

12

Слайд 12: Буква щ состоит из:

Изображение слайда

13

Слайд 13: Сравним буквы ш и щ:

Из Состоит буква ш Из Состоит буква щ

Изображение слайда

14

Слайд 14: Найди буквы Ш и Щ!!!

Изображение слайда

15

Слайд 15

Изображение слайда

16

Слайд 16: Прочитайте слоги: – строчками – столбиками

АШ – ША ОШ – ОЩ УШ – УЩ ША – ЩА ШО – ЩО ШУ – ЩУ ИШ – ИЩ ЕШ – ЕЩ ЁШ – ЁЩ ШИ – ЩИ ШЕ – ЩЕ ШЁ – ЩЁ

Изображение слайда

17

Слайд 17

ЁРШ ЩУКА корюшка горбуша ЛЕЩ ПОДЛЕЩИК пикша

Изображение слайда

18

Слайд 18: Рыбалка

Изображение слайда

19

Слайд 19: Стихотворение про рыбу

У РЫБЫ рыбья чешуя И рыбьи плавники. Нырнула вглубь рыбка моя, Прощайте, рыбаки !

Изображение слайда

20

Последний слайд презентации: Дифференциация звуков и букв Ш-Щ

Звук Ш – всегда твердый! Звук Щ – всегда мягкий! Буква Ш состоит из трех крючков! Буква Щ состоит из трех крючков и петельки! Все молодцы!!! Что мы с вами сегодня вспомнили?

Изображение слайда

Тема: «Дифференциация Ш-Щ»

Тема: «Дифференциация   Ш­Щ» 5 класс Диагноз: ОНР 3 уровня, нарушение письма Цель: Дифференцировать звуки [Ш – Щ], буквы «Ш» и «Щ»  Задачи: Образовательные: ­ уточнение и сравнение артикуляции звуков [Ш], [Щ], закрепление  зрительного образа букв «Ш» и «Щ», формирование умения  дифференцировать буквы и звуки в слогах, словах, предложениях;   Коррекционно­развивающие: ­ развитие фонематического восприятия зрительно­пространственных  представлений;  Воспитательные: ­ формирование навыков самоконтроля, положительной учебной  мотивации. Оборудование:      предметные   картинки   со   звуками   [Ш]   и   [Щ], индивидуальные  зеркала, карточки с заданиями.                               Ход занятия 1.Организационный момент. ­ Сядьте прямо, спинку держим ровненько, руки – на парту! 2.Артикуляционная гимнастика для  шипящих звуков. «Лопатка», «Накажем язычек», «Лошадка», «Качели», «Почистим зубки». Для рабочего настроя повторим  чистоговорки: Ша­ша­ша­наша Маша хороша.  Ша­ша­ша – есть у Маши ландыши. ­ Какой звук встречался чаще всего? Ща­ща­ща – дождь идёт, я без плаща. Ща­ща­ща – нет дождя, а я в плаще. ­ Какой звук встречался чаще всего?  3. Сообщение темы занятия.     Кто догадался, какие звуки будем различать на занятии? 4.Основная часть занятия.  Упражнение «Немое кино».  ­   Догадайтесь,   дети,   по   артикуляции   моих   губ,   какой   звук   я говорю?  [А, О, У, Ш, Щ]. Можно ли угадать, какой звук я говорю – [Ш] или [Щ]? Угадать по артикуляции губ невозможно, так как положение губ, зубов одинаково.  Уточнение и сравнение артикуляции звуков перед зеркалом.  Работа с артикуляционными профилями звуков. ­ Дайте характеристику звуку [Ш]  (согласный, твёрдый, глухой, парный)  и звуку [Щ] (согласный, мягкий, глухой, непарный). 5. Соотнесение звуков с буквами и символами, подходящими для их обозначения – Ш — будем обозначать синим кружком на письме. ­ Щ – зеленым кружком. 6. Дифференциация звуков в слогах. Ша­ща Шо­що Шу­щу Шы­щы 7. Дифференциация звуков в словах Шапка, щётка, плащ,  ландыш, мишка, лещ, щука,  вещи, мышь,  Аш­ащ Ош­ощ Уш­ущ бабушка, кошка, камыш. 8. Динамическая пауза. ­ Шарик надуваем – ш­ш­ш (руки через стороны вверх)  Шарик выпускает воздух щ­щ­щ (руки через стороны вниз).  Пальчиковая гимнастика. Пальцы сжали в кулачок, Карандаш зажали. А теперь давай, дружок, Разогни три пальца. И  подумай не спеша, Что за буква? Ясно – «Ш». 9. Развитие зрительного восприятия. Педагог раздает карточки и дает задание:           По команде зачеркните синей ручкой все буквы Ш, зелёной ручкой ­ все буквы Щ 10. Самостоятельная работа по карточкам. ­ Ребята к нам пришло письмо! Оно адресовано  нам с вами. А  отправил его Буратино. Он учится в школе и ему задали задания, с  которыми он просит ему помочь справиться (карточки).  Спиши, вставляя пропущенные буквы «Ш» и «Щ».  Взаимопроверка. Исправьте ошибки (читаем слова).  Вставь пропущенные буквы «Ш» и «Щ». Взаимопроверка. Исправьте ошибки (читаем текст). 11. Дифференциация букв занятия в слогах. Педагог   дает   карточки   на   которых   написаны   слоги   с   буквами занятия и просит раскрасить синим цветом слог с Ш, зеленым с Щ. 12. Итог занятия. 1. Спиши, вставляя пропущенные буквы «Ш» и «Щ», разделив их на два столбика. Один столбик с буквой «Ш», другой – «Щ». Ко..елёк,  ..есть,    ..арф,   пла..,   ..енок, я..ик, ..апка,  ..ар, ко..ка,  мы..ь 2.Вставь пропущенные буквы «Ш» или «Щ». ..енок.       ..енка поместили в поме..ении.  Между  ..кафом  и  боль..им  я..иком.  Постелька вы ­ ла тёплая.  По на..ей просьбе мама с..ила   ..енку   поду..ку.       Но    ..енок   укладывал   свой   хвост   на    поду..ку,   а ..екой   прислонялся  к   я..ику.      ..енок    вы..ипал    из  ..ётки    всю    ..етину.   Он  стра..но   боялся   ..екотки  и  мы..ей.         Ща­ща­ща – дождь идёт, я без плаща. Ще­ще­ще – нет дождя, а я в плаще. ША­ЩА ЩО­ШО ШИ­ЩИ ЩУ­ШУ ШУ­ШУ­ШУ ШЕ­ШЕ­ШЕ АШ­АЩ­АШ ОЩ­ОШ­ОШ УШ ­ УЩ – УШ ИЩ ­ ИШ ­ ИЩ ШАПКА, ЩЕТКА, ШАМПУНЬ,  ЩЕНОК, ШАРИК, ШАРФ, ЩЕКИ,  ЛАПША, КРЫША, ЯЩИК,  КАРАНДАШ, МАЛЫШ, ПЛАЩ

Дифференциация клеточной линии нейробластомы человека SH-SY5Y

J Vis Exp. 2016; (108): 53193.

Маккензи М. Шипли

1 Департамент биохимии и молекулярной биологии, Институт естественных наук им. Хака, Государственный университет Пенсильвании

Коллин А. Мангольд

1 Департамент биохимии и молекулярная биология, Институт наук о жизни Хака, Государственный университет Пенсильвании

Мориа Л.Szpara

1 Кафедра биохимии и молекулярной биологии, Институт естественных наук им. Хака, Университет штата Пенсильвания

1 Кафедра биохимии и молекулярной биологии, Институт наук о жизни Хака, Государственный университет Пенсильвании

Авторские права © 2016, Журнал визуализированных экспериментов Эта статья цитируется в других статьях PMC.

Abstract

Наличие соответствующих систем in vivo, и in vitro, , которые обеспечивают трансляционные модели заболеваний человека, является неотъемлемым аспектом исследований в области нейробиологии и нейробиологии.Традиционные экспериментальные модели in vitro , используемые в нейробиологии, включают первичные культуры нейронов крыс и мышей, линии клеток нейробластомы, включая клетки Neuro-2A крысы B35 и мыши, клетки PC12 крыс и краткосрочные культуры срезов. Хотя многие исследователи полагаются на эти модели, в них отсутствует человеческий компонент, и наблюдаемые экспериментальные эффекты могут быть исключительными для соответствующих видов и могут не проявляться одинаково у людей. Кроме того, хотя эти клетки являются нейронами, они могут иметь нестабильные кариотипы, что делает их использование проблематичным для исследований экспрессии генов и воспроизводимых исследований передачи сигналов клеток.Поэтому важно разработать более последовательные модели неврологических заболеваний человека.

Следующая процедура описывает простой воспроизводимый метод получения гомогенных и жизнеспособных культур нейронов человека путем дифференциации хромосомно стабильной линии клеток нейробластомы человека SH-SY5Y. Этот метод объединяет несколько ранее описанных методов 1-4 и основан на последовательном удалении сыворотки из среды. График включает постепенное голодание по сыворотке с введением белков внеклеточного матрикса и нейротрофических факторов.Это позволяет нейронам дифференцироваться, в то время как эпителиальные клетки отбираются против, что приводит к гомогенной культуре нейронов. Репрезентативные результаты демонстрируют успешную дифференциацию клеток нейробластомы SH-SY5Y от первоначального эпителиально-подобного клеточного фенотипа в более обширный и разветвленный нейрональный фенотип. Этот протокол предлагает надежный способ создания однородных популяций нейрональных культур, которые можно использовать для последующих биохимических и молекулярных анализов, что дает исследователям более точную трансляционную модель инфекции и болезни человека.

Ключевые слова: Биология развития, выпуск 108, SH-SY5Y, нейробластома, дифференциация, нейробиология, нейроны, инфекция, культура клеток

Введение

Возможность использования in vitro модельных систем значительно расширила области нейробиологии и нейробиологии. Клетки в культуре обеспечивают эффективную платформу для характеристики функциональности белков и молекулярных механизмов, лежащих в основе конкретных явлений, для понимания патологии болезней и инфекций и для проведения предварительных оценок тестирования на наркотики.В нейробиологии основные типы моделей клеточных культур включают первичные нейрональные культуры, полученные от крыс и мышей, и линии клеток нейробластомы, такие как клетки B35 крысы 5 , клетки мыши Neuro-2A 6 и клетки PC12 крысы 7 . Хотя использование таких клеточных линий значительно продвинулось в этой области, существует несколько сбивающих с толку факторов, связанных с обращением с нечеловеческими клетками и тканями. Сюда входит понимание видоспецифических различий в метаболических процессах, фенотипах проявления болезней и патогенезе по сравнению с людьми.Также важно отметить, что существуют значительные различия между экспрессией генов мыши и человека и передачей сигналов факторов транскрипции, подчеркивая ограничения моделей грызунов и важность понимания того, какие пути сохраняются между грызунами и людьми 8-11 . Другие использовали линии нейрональных клеток человека, включая линию клеток тератокарциномы человека N-Tera-2 (NT2) и индуцибельные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК). Эти клеточные линии представляют собой хорошие модели для in vitro и человеческих систем.Однако дифференцировка клеток NT2 ретиноевой кислотой (RA) приводит к образованию смешанной популяции нейронов, астроцитов и радиальных глиальных клеток 12 , что требует дополнительной стадии очистки для получения чистых популяций нейронов. Кроме того, клетки NT2 демонстрируют высоко вариабельный кариотип 13 , с более чем 60 хромосомами в 72% клеток. ИПСК демонстрируют вариабельность дифференцировки между различными клеточными линиями и разную эффективность дифференцировки 14 .Поэтому желательно иметь последовательную и воспроизводимую модель нейрональных клеток человека, дополняющую эти альтернативы.

Нейробластоподобные клетки SH-SY5Y являются субклоном родительской линии клеток нейробластомы SK-N-SH. Линия родительских клеток была создана в 1970 году из биопсии костного мозга, которая содержит как нейробластоподобные, так и эпителиально-подобные клетки 15 . Клетки SH-SY5Y имеют стабильный кариотип, состоящий из 47 хромосом, и их можно дифференцировать от нейробластоподобного состояния до зрелых нейронов человека с помощью множества различных механизмов, включая использование RA, сложных эфиров форбола и специфических нейротрофинов, таких как полученные из головного мозга. нейротрофический фактор (BDNF).Предыдущие данные свидетельствуют о том, что использование различных методов позволяет выбирать определенные подтипы нейронов, такие как адренергические, холинергические и дофаминергические нейроны 16,17 . Этот последний аспект делает клетки SH-SY5Y полезными для множества нейробиологических экспериментов.

В нескольких исследованиях были отмечены важные различия между клетками SH-SY5Y в их недифференцированном и дифференцированном состояниях. Когда клетки SH-SY5Y недифференцированы, они быстро пролиферируют и кажутся неполяризованными с очень небольшим количеством коротких отростков.Они часто растут группами и экспрессируют маркеры, указывающие на незрелые нейроны 18,19 . При дифференцировке эти клетки удлиняют длинные разветвленные отростки, уменьшают пролиферацию и в некоторых случаях поляризуют 2,18 . Ранее было продемонстрировано, что полностью дифференцированные клетки SH-SY5Y экспрессируют множество различных маркеров зрелых нейронов, включая белок, связанный с ростом (GAP-43), ядра нейронов (NeuN), синаптофизин (SYN), белок синаптических везикул II (SV2), нейрон-специфическая энолаза (NSE) и белок, связанный с микротрубочками (MAP) 2,16,17,20 , и отсутствие экспрессии глиальных маркеров, таких как глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) 4 .В качестве дополнительного подтверждения того, что дифференцированные клетки SH-SY5Y представляют собой гомогенную популяцию нейронов, удаление BDNF приводит к клеточному апоптозу 4 . Это предполагает, что выживание дифференцированных клеток SH-SY5Y зависит от трофических факторов, как и у зрелых нейронов.

Использование клеток SH-SY5Y увеличилось с момента создания субклона в 1978 г. 3 . Некоторые примеры их использования включают исследование болезни Паркинсона 17 , болезни Альцгеймера 21 и патогенеза вирусной инфекции, включая полиовирус 22 , энтеровирус 71 (EV71) 23,24 , вирус ветряной оспы (VZV) 1 , цитомегаловирус человека 25 и вирус простого герпеса (HSV) 2,26 .Важно отметить, что в нескольких исследованиях с использованием клеток SH-SY5Y эти клетки использовались в их недифференцированной форме, особенно в области нейровирологии 27-36 . Разница в наблюдаемом фенотипе недифференцированных и дифференцированных клеток SH-SY5Y поднимает вопрос о том, будет ли наблюдаемое прогрессирование инфекции отличаться в зрелых дифференцированных нейронах. Например, дифференцированные клетки SH-SY5Y имеют более высокую эффективность поглощения HSV-1 по сравнению с недифференцированными, пролиферирующими клетками SH-SY5Y, что может быть связано с отсутствием поверхностных рецепторов, которые связывают HSV и модулируют проникновение в недифференцированные клетки SH-SY5Y 2 .Поэтому очень важно, чтобы при разработке эксперимента, направленного на тестирование нейронов in vitro , клетки SH-SY5Y должны быть дифференцированы, чтобы получить наиболее точные результаты для трансляции и сравнения с моделями in vivo .

Разработка надежного метода создания культур человеческих нейронов необходима, чтобы исследователи могли проводить трансляционные эксперименты, точно моделирующие нервную систему человека. Представленный здесь протокол представляет собой процедуру, которая описывает лучшие практики, полученные из предыдущих методов 1-4 , для обогащения человеческих нейронов, которые дифференцируются с помощью ретиноевой кислоты.

Протокол

1. Общие положения

  1. Список необходимых реагентов см. В Таблице материалов / оборудования . Выполняйте все шаги в строгих асептических условиях.

  2. Используйте термоинактивированную фетальную телячью сыворотку (hiFBS) для всех препаратов сред, содержащих FBS. Для инактивации нагреванием нагрейте аликвоту 50 мл FBS при 56 ° C в течение 30 минут, переворачивая каждые 10 минут (см. Также , таблица 1, ). Примечание. При использовании FBS без тепловой инактивации эпителиально-подобный фенотип быстрее прогрессирует в культурах клеток SH-SY5Y.

  3. Перед использованием дайте среде нагреться и уравновеситься в инкубаторе для установления надлежащего баланса pH перед каждым шагом. Например, для полного уравновешивания 50 мл среды требуется приблизительно один час (pH 7, 37 ° C, 5% CO 2 ). Примечание. В этом протоколе используется двухэтапная процедура расщепления, которая требует, чтобы частично дифференцированные клетки SH-SY5Y были трипсинизированы и повторно посеяны. Это стрессовый процесс для этих исключительно хрупких клеток. Поэтому важно инкубировать клетки в трипсине в течение минимального времени.Это обеспечит предпочтительный отрыв нейронов, оставив эпителиоподобные клетки, все еще прикрепленные к чашке.

  4. Медленно растирайте дифференцированные клетки пластиковой пипеткой на 10 мл, прижав кончик ко дну конической пробирки, содержащей клетки. Выполните растирание на медленной скорости, вверх и вниз не более пяти раз.

2. Пассирование поддерживающих культур SH-SY5Y

  1. Разделение поддерживающих культур, когда клетки достигли 70-80% слияния и не превышают 10-15 пассажей.Культуры обычно необходимо пересевать каждые 3-5 дней (при условии, что культуры не разбавляются более чем в 5 раз во время разделения).

  2. Для пассирования клеток из колбы Т-75 аспирируйте среду, затем промойте примерно 10 мл 1x PBS. Примечание. Мы не рекомендуем разделять поддерживающие культуры SH-SY5Y дальше 1: 5 во время пассирования, поскольку это может привести к гибели клеток из-за низкой слияния.

  3. Аспирируйте PBS, а затем добавьте 2,5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА (1x).

  4. Инкубируйте в инкубаторе 2-3 мин и осторожно наклоните, чтобы высвободить клетки с поверхности колбы.

  5. Добавьте 10 мл основной питательной среды (см. , таблицу 2, ) и растереть 1-2 раза.

  6. Вращайте в течение 2 минут при 1000 x g, аспирируйте среду, затем ресуспендируйте осадок в 5 мл основной среды для выращивания.

  7. Разведите клетки от 1: 3 до 1: 5 в общем объеме 20 мл для нормального посева в колбу Т-75 или подсчитайте и поместите на планшет для дифференцировки (раздел 5).

3. Замораживание клеток SH-SY5Y

  1. Замораживание ранних пассажей клеток нейробластомы SH-SY5Y в основной ростовой среде с добавлением 5% (об. / Об.) ДМСО.

  2. Сначала заморозьте аликвоты при -80 ° C на 24 часа, затем перенесите в жидкий азот для длительного хранения. Примечание. Для справки: конфлюэнтная (75-85%) колба Т-75 даст пять аликвот по 1 мл клеток SH-SY5Y для замораживания. Каждая из этих аликвот должна содержать от 2 до 5 миллионов клеток.

4. Размораживание и культивирование недифференцированных клеток нейробластомы SH-SY5Y

  1. Приготовьте базовую питательную среду.

  2. Быстро разморозьте замороженные клетки на водяной бане 37 ° C (примерно 2 мин).

  3. Ресуспендируйте клетки в 9 мл основной среды для роста в конической пробирке на 15 мл, а затем центрифугируйте в течение 2 минут при 1000 x g.

  4. Аспирируйте супернатант, стараясь не повредить осажденные клетки, и осторожно ресуспендируйте клетки в 10 мл основной среды для роста.

  5. Перенесите клетки в колбу Т-25 или чашку 60 мм 2 .

  6. На следующий день замените среду для удаления мертвых клеток.

5. День 0: Посев клеток для дифференцировки

  1. График дифференцировки см. На рис. 1 .

  2. Промыть недифференцированные клетки 1 раз в PBS, аспирировать и затем трипсинизировать, используя 1-2 мл нагретого 1 раза 0,05% трипсина-ЭДТА.

  3. Когда клетки находятся в трипсине, инкубируйте примерно 3 мин в инкубаторе.

  4. Погасите трипсин, добавив 10 мл основной среды для выращивания, ополосните стенки колбы или чашки и осторожно растереть в порошок 1-3 раза. Перенести содержимое в коническую пробирку на 15 мл.

  5. Центрифуга в течение 2 минут при 1000 x g и аспирируйте среду, стараясь не повредить осадок.

  6. Ресуспендируйте осадок в 5 мл основной питательной среды и растереть 1-3 раза.

  7. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра, затем разбавьте с помощью базовой среды для роста до 50 000 клеток / мл.

  8. Чашка 2 мл клеток на 35 мм 2 Чашка , всего 100000 клеток на чашку и поместите обратно в инкубатор.

6. День 1: Смена среды (среда для дифференциации № 1)

  1. Аликвота 50 мл среды для дифференциации № 1 (см. , таблица 2, ) и инкубирование на водяной бане при 37 ° C.

  2. Когда среда нагрета, дайте ей уравновеситься в инкубаторе (37 ° C, 5% CO 2 ) в течение как минимум одного часа для установления надлежащего баланса pH перед использованием.

  3. Добавьте ретиноевую кислоту (RA) (см. таблицу 1 ) в нагретую и уравновешенную среду непосредственно перед добавлением среды в чашки. Примечание. Ретиноевая кислота чувствительна к свету, и ее следует хранить в темных бутылях при 4 ° C.

  4. Осторожно удалите старую среду и выбросьте.

  5. Добавьте 2 мл среды для дифференциации № 1 с RA на каждые 35 мм 2 чашки и верните в инкубатор.

7. День 3: Смена носителя (носитель дифференциации № 1)

  1. Повторите раздел 6 (шаги 1-5)

8.День 5: Смена среды (среда для дифференциации # 1)

  1. Повторите раздел 6 (шаги 1-5)

9. День 7: Разделение клеток 1: 1

  1. Добавление RA к нагретой и уравновешенной среде для дифференциации # 1 непосредственно перед добавлением СМИ в посуду.

  2. Осторожно удалите старый носитель и выбросьте.

  3. Добавьте 200 мкл нагретого 0,05% 1x трипсина EDTA на 35 мм чашку 2 и нагрейте в инкубаторе примерно 2-3 мин или до тех пор, пока клетки не будут заметно приподняты с планшета, как наблюдали под микроскопом.

  4. Погасить трипсин, добавив 2 мл среды для дифференцировки № 1 с RA на 35 мм 2 чашка и использовать среду для смывания оставшихся нейронных клеток с планшета. Затем перенесите содержимое в коническую пробирку на 50 мл. Примечание. На этапах трипсинизации не обрабатывайте слишком много блюд одновременно. Это помогает гарантировать, что культуры нейронов не инкубируются в трипсине слишком долго, что может быть цитотоксичным.

  5. Смешайте содержимое до 10 чашек в конической пробирке на 50 мл и аккуратно растирайте в порошок вверх и вниз не более пяти раз пластиковой пипеткой на 10 мл.

  6. Аликвотировать 2 мл клеточной суспензии в свежие чашки диаметром 35 мм 2 и вернуть в инкубатор.

10. День 8: Смените среду (Среда для дифференциации # 2)

  1. Добавьте RA (см. Таблица 1 ) в нагретую и уравновешенную среду непосредственно перед добавлением среды в чашки.

  2. Осторожно удалите старый носитель и выбросьте.

  3. Медленно добавьте 2 мл среды для дифференциации № 2 (см. таблицу 2 ) с RA на каждые 35 мм 2 чашку и верните в инкубатор.Не позволяйте нейронам находиться на воздухе в течение длительного периода времени, так как они могут быстро высохнуть.

11. День 9: Приготовление покрытых внеклеточным матриксом (ЕСМ) чашек

  1. Оттаять один флакон с раствором ЕСМ на льду и развести 1: 100 в холодной среде DMEM.

  2. Выдавите по 2 мл смеси в каждую чашку диаметром 35 мм. 2 и убедитесь, что все дно чашки покрыто.

  3. Поместите в инкубатор (37 ° C, 5% CO 2 ) на 1 час или на ночь.

  4. Аспирируйте смесь и дайте высохнуть на воздухе в течение примерно 1 часа в вытяжном шкафу. Хранить при комнатной температуре до 2 месяцев.

12. День 10: Перенос клеток на планшеты, покрытые ECM 1: 1

  1. Добавьте RA (см. таблицу 1 ) в нагретую и уравновешенную среду непосредственно перед добавлением среды в чашки.

  2. Осторожно удалите носитель и выбросьте его.

  3. Добавьте 200 мкл подогретого трипсина в каждую 35-миллиметровую чашку 2 и дайте инкубироваться при комнатной температуре примерно 1-2 мин или до тех пор, пока нейроны не будут заметно приподняты из чашки, как наблюдали под микроскопом.Примечание. Выполняйте этот этап трипсинизации при комнатной температуре, чтобы не переинкубировать нейроны с трипсином и не вызвать повреждения. На этой стадии нейроны высвобождаются из пластинок намного быстрее, чем эпителиально-подобные клетки.

  4. Погасите трипсин, добавив 2 мл среды для дифференцировки № 2 на чашку диаметром 35 мм 2 и используйте среду, чтобы смыть оставшиеся нейрональные клетки с планшета. Затем перенесите содержимое в коническую пробирку на 50 мл.

  5. Смешайте содержимое до 10 чашек в конической пробирке на 50 мл и аккуратно растирайте в порошок вверх и вниз не более пяти раз пластиковой пипеткой на 10 мл.

  6. Внесите 2 мл клеточной суспензии в покрытые ECM чашки диаметром 35 мм 2 и верните в инкубатор.

13. День 11: Смените среду (Среда для дифференциации № 3)

  1. Добавьте RA (см. Таблица 1 ) в нагретую и уравновешенную среду непосредственно перед добавлением среды в чашки.

  2. Осторожно удалите старый носитель и выбросьте.

  3. Медленно добавьте 2 мл среды для дифференциации № 3 (см. таблицу 2 ) с RA на каждые 35 мм 2 чашки и верните в инкубатор.Не позволяйте нейронам находиться на воздухе в течение длительного периода времени.

14. День 14: Смена носителя (Среда для дифференциации № 3)

  1. Повторите раздел 13 (шаги 1–3)

15. День 17: Последняя смена носителя (Среда для дифференцирования № 3)

  1. Повторите раздел 13 (шаги 1-3)

16. День 18: Нейрональные культуры готовы к использованию

  1. Меняйте среду на свежую среду для дифференцировки № 3 с RA каждые 3 дня для поддержания здоровья нейронов.Примечание: клетки должны дифференцироваться в нейроны и проявлять нейрональный фенотип. Культуры обычно стабильны до 14 дней после терминальной дифференцировки, однако продолжительность жизнеспособности нейронов зависит от числа пассажей недифференцированных клеток в начале дифференцировки. Более высокое число проходов дает дифференцированные нейроны с более коротким сроком службы.

Репрезентативные результаты

В настоящее время есть много примеров в области нейробиологии и нейровирологии, где недифференцированные клетки SH-SY5Y используются в качестве функциональной модели для нейронов человека 27-36 , и, что важно, недифференцированные клетки могут отсутствуют фенотипы, такие как оптимальное поглощение вируса 2 , которые необходимы для точной интерпретации.Очень важно, чтобы при использовании клеток SH-SY5Y или любой другой нейронной системы in vitro клетки соответствующим образом дифференцировались в нейроны, чтобы получить данные, которые являются наилучшим возможным представлением того, что может происходить в нейронах in vivo . Вышеупомянутый протокол дает очень жизнеспособные, гомогенные, дифференцированные культуры нейронов в течение 18 дней, которые можно использовать для последующих биохимических анализов и визуализации. Недифференцированные клетки нейробластомы SH-SY5Y демонстрируют большой плоский эпителиоподобный фенотип с многочисленными короткими отростками, идущими наружу ( Рисунок 2A, ), в то время как дифференцированные клетки обладают несколькими нейритными выступами, которые соединяются с окружающими клетками ( Рисунок 2B, ).Важно, чтобы при дифференцировке клеток SH-SY5Y клетки инкубировали с трипсином в течение минимального периода времени, чтобы гарантировать, что из чашки высвобождаются только нейроны. Это оставляет недифференцированные эпителиальные клетки, которые в противном случае загрязняли бы популяцию дифференцированных нейрональных клеток. Нейрональные характеристики полностью дифференцированных клеток SH-SY5Y демонстрируются такими методами, как иммунофлуоресцентное обнаружение классических нейрональных маркеров (, рис. 3, ).

Клетки SH-SY5Y демонстрируют множество различных фенотипов в ходе дифференцировки, и важно уметь отличать здоровые нейроны от тех, которые подвергаются стрессу. В день дифференцировки 1, перед введением среды дифференцировки № 1, клетки имеют плоский ретракционный фенотип с короткими короткими отростками (, фиг. 4A, ). После 5 дней лишения сыворотки клетки SH-SY5Y начинают развивать более длинные проекции и демонстрируют более нейрональный фенотип ( Рисунок 4B, ).Пассирование – тяжелый процесс для клеток SH-SY5Y, и в первые дни после пассажа клетки кажутся нездоровыми. Об этом свидетельствует слипание тела клеток и наличие меньшего количества более коротких отростков. (См. Изображения до: Фигуры 4C, и 4E , и изображения после: Фигуры 4D, и , 4F ). Примерно через 48 часов после расщепления клетки, по-видимому, восстанавливаются, и полностью зрелые дифференцированные нейроны получают на 18-й день (, фиг. 2B, ). Об этом свидетельствует уменьшение скопления клеточного тела и расширение множества тонких разветвленных нейритных отростков, которые часто соединяются с соседними клетками.

Факторы, которые необходимы для получения воспроизводимых и жизнеспособных культур нейронов, включают использование термоинактивированной FBS, минимизацию времени инкубации с трипсином и мягкое растирание. Важно отметить, что в этом протоколе подробно описано использование четырех различных составов сред с различными концентрациями hiFBS, тем самым создавая плавный переход клеток в состояние нехватки сыворотки. Когда зрелые клетки SH-SY5Y здоровы, они демонстрируют многочисленные выступы, которые соединяются с окружающими нейронами ( Рисунок 5A, ).Следует отметить, что отличительный эпителиальный фенотип будет преобладать над культурами нейронов, если с ними неправильно обращаться в процессе дифференцировки ( Рисунок 5B, ). Кроме того, если нейроны начнут умирать, нейриты будут втягиваться, тела клеток начнут сгущаться вместе и округляться, а остатки дегенерации нейритов начнут накапливаться в клеточных отростках и вокруг них. Этот процесс похож на то, что продемонстрировано на фигурах , 5C, и 5D. В то время как , фиг. 5C, показывает более естественное развитие клеточной гибели после лишения питательных веществ и окружающей среды, Рисунок 5D. показывает дифференцированные нейроны SH-SY5Y через 4 часа после инфицирования штаммом HSV-1, KOS, при множественном инфицировании (MOI ) из 10 6 БОЕ.Этот протокол был тщательно оптимизирован в лаборатории и дает воспроизводимые гомогенные популяции нейронов, которые необходимы для последующего анализа и экспериментов.

Рисунок 1: График проведения процедуры дифференциации. Процесс дифференциации состоит из 11 этапов в течение 18 дней. В первый день протокола дифференцировки (день 0) от 25000 до 100000 клеток высевают на чашки диаметром 35 мм без покрытия. В дни 1, 3 и 5 старый носитель удаляется и применяется среда дифференцирования №1.На 7-й день клетки разделяют в соотношении 1: 1 на чашки диаметром 35 мм без покрытия в среде для дифференцировки №1. На 8-й день среду заменяют на среду для дифференциации №2, а на 10-й день клетки снова разделяют в соотношении 1: 1, но на этот раз на 35-миллиметровые чашки, покрытые ECM, в среде для дифференциации №2. В дни 11, 14 и 17 старый носитель удаляется и применяется среда дифференцирования № 3. На 18 день дифференцированные нейроны готовы к использованию для последующих приложений.

Рисунок 2: Морфологический вид недифференцированных и дифференцированных клеток SH-SY5Y. ( A ) Недифференцированные клетки SH-SY5Y имеют плоский фенотип с небольшим количеством выступов, тогда как ( B ) дифференцированные нейроны SH-SY5Y демонстрируют обширные и удлиненные нейритные выступы. Изображения получали синфазно при 20-кратном увеличении с использованием инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа.

Рисунок 3: Маркеры дифференцировки нейронов. Иммунофлуоресценция освещает нейрональные особенности полностью дифференцированных клеток SH-SY5Y. ( A ) Анти-SMI31 (зеленый) окрашивает фосфорилированный нейрофиламент H в обширной сети нейритов.( B ) Анти-MAP2 (красный) маркирует связанный с микротрубочками белок 2, выявляя сому нейронов и проксимальную часть нейритов. Соответствующее фазовое изображение для каждой панели иммунофлуоресценции показано справа. Изображения были получены при 10-кратном увеличении с использованием инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа. Шкала 100 мкм.

Рисунок 4: Промежуточные этапы протокола дифференциации. ( A ) День 1 дифференциации. Клетки сохраняют ретракционный фенотип с короткими выступами.( B ) Пятый день дифференциации. Клетки подвергали 5-дневной депривации сыворотки (среда для дифференциации № 1). Выжившие клетки начинают удлиняться и образовывать более длинные отростки, которые соединяются с соседними клетками. ( C ) 7-й день дифференциации до разделения. Клетки демонстрируют большое количество длинных отростков с меньшим количеством клеток, демонстрирующих эпителиально-подобный фенотип. ( D ) 8-й день дифференциации, через день после первого пассажа. После расщепления тела клеток образуют сгустки, и в результате процедуры пассирования отростки становятся короткими.( E ) День 10 дифференцировки перед разделением на планшеты, покрытые ECM. Клетки демонстрируют более длительные процессы, которые устанавливают связь с соседними клетками. Также очевидна кластеризация клеточных тел. ( F ) Одиннадцатый день дифференциации, один день после второго разделения. Клетки подвергаются стрессу после второго пассажа, и многие нейроны в конечном итоге теряются. Однако оставшаяся популяция является жизнеспособной, гомогенной и нейрональной по фенотипу. Тела клеток производят более крупные кластеры, и от основания кластеров начинают исходить процессы.

Рисунок 5: Разрастание эпителия и гибель нейронов – два альтернативных результата процесса дифференцировки. ( A ) Здоровые зрелые нейроны SH-SY5Y демонстрируют диффузные аксональные проекции, соединяющиеся с соседними клетками. ( B ) В некоторых случаях клетки с более эпителиоподобным фенотипом превосходят поддерживающие культуры. Такое перенаселение эпителиоподобных клеток может быть связано с нечастым пассированием поддерживающих культур. Эти культуры следует выбросить, так как эпителиально-подобных клеток будет по-прежнему больше, чем нейронов.Стрелки обозначают эпителиоподобные клетки. ( C ) Когда клетки SH-SY5Y нездоровы и начинают умирать, тела клеток собираются и процессы разлагаются, образуя значительное количество мусора. ( D ) Заметное накопление клеточного мусора и ретракция нейронных отростков очевидны в зрелых дифференцированных нейронах через 4 часа после инфицирования штаммом KOS вируса простого герпеса 1 (HSV-1) при множественности инфекции (MOI) 10 6 БОЕ.

Компонент Детали Акции Инструкции
10 мкМ RA Полностью транс-ретиноевая кислота 5 мМ Ресуспендируйте 50 мг RA в 33.3 мл 95% этанола. РА чувствителен к теплу, свету и воздуху. Хранить в темной бутылке и хранить при 4 ° C до 6 недель. Используйте при разведении 1: 500 и разведите в среде дифференциации непосредственно перед использованием
(300,44 г / моль)
1x B-27 B-27 Supplement 50x Разморозьте флакон 1-10 мл и аликвоты остатка в одноразовые аликвоты объемом 1 мл и хранить при -80 ° C. Храните флаконы объемом 10 мл при -20 ° C
20 мМ KCl Хлорид калия 1 M Добавьте 250 мл воды к 18.6 г KCl и стерильный фильтр. Хранить при комнатной температуре
(74,55 г / моль)
2 мМ db-cAMP дибутирилциклический AMP 1 M Ресуспендируйте полную бутылку, добавив 2,04 мл воды к 1 г db-cAMP. Чувствителен к свету и влаге. Хранить аликвотами по 100 или 200 мкл при -20 ° C или -80 ° C
(491,37 г / моль)
50 нг / мл BDNF нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) Флакон центрифуги, чтобы порошок опустился на дно.Ресуспендируйте флакон 10 мкг в 1 мл нейробазала + 1x B27 или 5 мкг флакона в 0,5 мл Neurobasal + 1x B27, чтобы получить 10 мкг / мл. Использовать в разведении 1: 200. Храните рабочие аликвоты при -80 ° C (например, 250 мкл)
hiFBS Инактивированная нагреванием фетальная бычья сыворотка Размороженные аликвоты FBS помещают в конические пробирки на 50 мл. Нагрейте до 56 ° C на водяной бане 30 мин. Удалить и заморозить рабочие аликвоты при -20 ° C

Таблица 1: Исходные растворы и компоненты.

10057
Базовая среда роста
Компонент Объем на 500 мл Разведение
EMEM 415 мл EMEM
15% hiFBS 75 мл hiFBS
1x Pen / Strep 9057 9057 905 Pen / Strep 1 2 мМ глутамина 5 мл глутамина 1: 100
* Срок хранения не более 6 недель
Среда дифференциации № 1
Компонент Объем на 50 мл Разведение
EMEM 48 мл EMEM
2.5% hiFBS 1,3 мл hiFBS
1x Pen / Strep 500 мкл Pen / Strep 1: 100
2 мМ Глутамин 500 мкл Глютамин 10 мкМ RA 100 мкл RA (5 мМ исходный раствор) 1: 500
* Держите максимум 2 недели и добавьте RA непосредственно перед использованием
* Не храните лишнюю среду после добавления RA – РА нестабильно
Среда дифференциации № 2
Компонент Объем на 50 мл Разведение
EMEM 49 мл EMEM
1% hiFBS 500 мкл hiFBS
1x Pen / Strep 5001 9057 9057 905 905 905 1 Strep 1 Pen / Strep 2 мМ глутамина 500 мкл глутамина 1: 100
10 мкМ RA 100 мкл RA (5 мМ исходный раствор) 1: 500
* Хранить максимум 2 недели и добавлять RA непосредственно перед используйте
* Не храните лишние носители после добавления RA – RA нестабильно
Среда дифференциации № 3
Компонент Объем на 50 мл Разведение
Нейробазал 47 мл Нейробазал
1x B-27 1 мл B-27 (запас 50X) 1:50
20 мМ KCl 905M KCl 905 (1 мл 578 905) запас) 1:50
1x Pen / Strep 500 мкл Pen / Strep 1: 100
2 мМ GlutamaxI 500 мкл GlutamaxI (100x шток) 1:
50 нг / мл BDNF 250 мкл исходного BDNF (10 мкг / мл) 1: 200
2 мМ дибутирилциклический AMP (db-cAMP) 100 мкл db-cAMP8 (1M Stock) 9057 1: 500
10 мкМ RA 100 мкл RA (5 мМ исходный раствор) 1: 500
* Хранить максимум 2 недели и добавлять RA непосредственно перед использованием
* Не сохранить дополнительные носители после добавления RA – RA нестабильно

Таблица 2: Рецепты средств массовой информации.

Обсуждение

Приведенный выше протокол обеспечивает простой и воспроизводимый метод создания гомогенных и жизнеспособных культур нейронов человека. В этом протоколе используются методы и практики, которые объединяют несколько ранее опубликованных методов 1-4 , и нацелен на определение лучших практик каждого из них. Дифференциация клеток SH-SY5Y основана на постепенной депривации сыворотки; добавление ретиноевой кислоты, нейротрофических факторов и белков внеклеточного матрикса; и последовательное расщепление для отбора дифференцированных зрелых адгезивных нейронов.Эта клеточная линия начинается с гетерогенной популяции прикрепленных и взвешенных клеток. Этот протокол направлен на сохранение обеих популяций путем отказа от промывки PBS перед пассированием или сменой среды, но для удаления мертвых эпителиальных клеток необходима некоторая потеря взвешенных клеток. Представленный метод производит гомогенную популяцию дифференцированных нейронов SH-SY5Y человека для дальнейших экспериментов.

Хотя другие агенты могут использоваться для направления дифференцировки нейронов в холинергический или адренергический фенотип 16,17 , использование RA для дифференциации клеток SH-SY5Y ранее использовалось для получения нейронов с дофаминергическим фенотипом 37, 38 .Было показано, что добавление RA вызывает клеточную дифференцировку посредством ряда механизмов, включая остановку развития клеточного цикла из G0 / G1, повышение экспрессии ингибиторов циклин-зависимой киназы (CDK) p21 и p27 Kip1 и антиапоптотических белки Bcl-2 и Bcl-xL и усиление активности PI3K / AKT, которая играет роль в развитии и дифференцировке нейритов 39 .

Крайне важно на протяжении всего выполнения этого протокола использовать щадящие и стерильные методы обращения, поскольку клетки SH-SY5Y очень чувствительны к внезапным изменениям.Именно из-за этой чувствительности протокол постепенной депривации сыворотки предпочтительнее протоколов, требующих быстрых изменений в составе среды. При расщеплении клеток на 7 и 10 дни важно минимизировать количество времени, которое частично дифференцированные нейроны проводят в трипсине. Это снижает вероятность повреждения нейронов и способствует преимущественному высвобождению нейронов по сравнению с эпителиальными клетками, для отделения которых требуется больше времени. Это помогает создать более однородную популяцию нейронных клеток и минимизировать загрязнение пролиферирующими и недифференцированными эпителиальными клетками.Также важно отметить, что реагенты, используемые для культивирования и дифференцировки клеток SH-SY5Y, должны регулярно заменяться, а не храниться бесконечно. Например, Basic Growth Media можно хранить до 6 недель, а Differentiation Media – только до 2 недель. Это гарантирует, что такие реагенты, как dbcAMP и BDNF, свежие и стабильные. Кроме того, приготовленный RA следует хранить не более 6 недель в темноте, прежде чем будет произведена новая партия. Мы наблюдали большую согласованность результатов нейронов с этими мерами предосторожности.

После того, как клетки дифференцировались в зрелые нейроны, их можно поддерживать до 2 недель после окончания дифференцировки и использовать для экспериментов. После терминальной дифференциации среду следует менять каждые 3-4 дня (среда дифференциации № 3). В отличие от дифференцированных нейронов колбы для обслуживания, содержащие культуры недифференцированных клеток SH-SY5Y, могут храниться в течение многих недель при регулярном пассировании. Важно регулярно проводить пассажи поддерживающих культур, чтобы предотвратить перенаселение эпителиоподобных клеток, которые больше не способны дифференцироваться в нейроны.Когда этих клеток больше, чем клеток с нейропотенциалом, голодание по сыворотке вызовет непропорционально большое количество гибели клеток. Недифференцированные культуры можно поддерживать только примерно до 15 пассажей. После того, как культура превысит 15 пассажей, недифференцированные клетки начинают умирать и приобретают грубый нездоровый вид. Кроме того, дифференциация клеток SH-SY5Y с высоким числом пассажей является более сложной, поскольку меньшее количество клеток выживет при каждом расщеплении, а те, которые действительно часто агрегируют как тела клеток, так и аксоны, затрудняя последующий анализ.

Наблюдается отчетливое уменьшение количества клеток в процессе дифференцировки, так как многие клетки теряются или не выживают в процессе расщепления. Таким образом, в начале любого эксперимента с участием дифференцированных клеток SH-SY5Y следует учитывать потерю нейронов примерно на 30-40% и обеспечить правильное количество клеток, высеянное в начале, для достижения желаемого выхода. В то время как высев 100000 клеток дает большое количество здоровых зрелых нейронов SH-SY5Y, меньшее или большее количество может быть первоначально высеяно в зависимости от экспериментальных потребностей.

Очевидно, что полностью дифференцированные нейроны SH-SY5Y обеспечивают более близкое приближение к зрелым нейронам человека, обнаруженным in vivo , чем их недифференцированные аналоги клеток-предшественников ( Рисунок 2, ). Эти нейроны обеспечат выгодную модель для будущих характеристик их нейробиологии, для изучения нейротропных вирусов или для скрининга химиотерапевтической токсичности в нейронах.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарны Иоланде Тафури за вклад в оптимизацию условий дифференциации SH-SY5Y, а также за поддержку доктора Линн Энквист, в лаборатории которой была начата эта работа. Y. Tafuri предоставил изображения, показанные на рисунке 3. Эта работа была поддержана Центром ресурсов биоинформатики NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR) (MLS и L. Enquist) и K22 AI095384 (MLS).

Ссылки

  • Christensen J, Steain M, Slobedman B, Abendroth A.Дифференцированные клетки нейробластомы представляют собой высокоэффективную модель для изучения продуктивной инфекции нейрональных клеток вирусом ветряной оспы. Журнал вирусологии. 2011. 85 (16): 8436–8442. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Гименес-Кассина А., Лим Ф., Диас-Нидо Дж. Дифференциация нейробластомы человека в нейроноподобные клетки увеличивает их восприимчивость к трансдукции герпесвирусными векторами. Журнал неврологических исследований. 2006. 84 (4): 755–767. [PubMed] [Google Scholar]
  • Biedler JL, Roffler-Tarlov S, Schachner M, Freedman LS.Синтез множественных нейротрансмиттеров клеточными линиями и клонами нейробластомы человека. Исследования рака. 1978. 38 (11 Pt 1): 3751–3757. [PubMed] [Google Scholar]
  • Энсинас М., Иглесиас М. и др. Последовательная обработка клеток SH-SY5Y ретиноевой кислотой и нейротрофическим фактором головного мозга приводит к появлению полностью дифференцированных нейротрофических фактор-зависимых клеток человека. Журнал нейрохимии. 2000. 75 (3): 991–1003. [PubMed] [Google Scholar]
  • Otey CA, Boukhelifa M, Maness P.Клетки нейробластомы B35: легко трансфицируемая культивируемая клеточная модель нейронов центральной нервной системы. Методы клеточной биологии. 2003. 71: 287–304. [PubMed] [Google Scholar]
  • LePage KT, Dickey RW, Gerwick WH, Jester EL, Murray TF. Об использовании клеток нейробластомы neuro-2a по сравнению с интактными нейронами в первичной культуре для исследований нейротоксичности. Критические обзоры в нейробиологии. 2005. 17 (1): 27–50. [PubMed] [Google Scholar]
  • Шафер Т.Дж., Атчисон В.Д. Передатчик, ионный канал и рецепторные свойства клеток феохромоцитомы (PC12): модель для нейротоксикологических исследований.Нейротоксикология. 1991. 12 (3): 473–492. [PubMed] [Google Scholar]
  • Yue F, Cheng Y, et al. Сравнительная энциклопедия элементов ДНК в геноме мыши. Природа. 2014. 515 (7527): 355–364. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Cheng Y, Ma Z, et al. Принципы сохранения регуляторной информации между мышью и сохранения между мышью и человеком. Природа. 2014; 515 (7527): 371–375. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Stergachis AB, Neph S, et al.Сохранение транс-действующих схем во время регуляторной эволюции млекопитающих. Природа. 2014; 515 (7527): 365–370. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Lin S, Lin Y, et al. Сравнение транскрипционных ландшафтов между тканями человека и мыши. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2014. 111 (48): 17224–17229. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Coyle DE, Li J, Baccei M. Региональная дифференциация индуцированных ретиноевой кислотой нейронов стволовых клеток плюрипотентной эмбриональной карциномы человека.PLoS ONE. 2011; 6 (1): e16174. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Мостерт М.М., ван де Поль М. и др. Подходы на основе флуоресценции на основе гибридизации in situ для обнаружения избыточного представительства 12p, в частности i (12p), в клеточных линиях опухолей половых клеток яичек человека взрослых. Генетика и цитогенетика рака. 1996. 87 (2): 95–102. [PubMed] [Google Scholar]
  • Hu B-Y, Weick JP, et al. Нейронная дифференцировка индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток следует принципам развития, но с переменной эффективностью.Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2010. 107 (9): 4335–4340. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Biedler JL, Helson L, Spengler BA. Морфология и рост, онкогенность и цитогенетика клеток нейробластомы человека в непрерывной культуре. Исследования рака. 1973; 33 (11): 2643–2652. [PubMed] [Google Scholar]
  • Påhlman S, Ruusala AI, Abrahamsson L, Mattsson ME, Esscher T. Дифференцировка культивируемых клеток нейробластомы человека, индуцированная ретиноевой кислотой: сравнение с дифференцировкой, индуцированной форболестером.Дифференциация клеток. 1984. 14 (2): 135–144. [PubMed] [Google Scholar]
  • Xie H, Hu L, Li G. Линия клеток нейробластомы человека SH-SY5Y: клеточная модель дофаминергических нейронов при болезни Паркинсона in vitro. Китайский медицинский журнал. 2010. 123 (8): 1086–1092. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ковалевич Дж., Лэнгфорд Д. Методы молекулярной биологии. Vol. 1078. Клифтон, штат Нью-Джерси: 2013. Соображения по использованию клеток нейробластомы SH-SY5Y в нейробиологии; С. 9–21. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Påhlman S, Hoehner JC, et al.Влияние факторов роста на дифференцировку и выживаемость в нейробластоме человека. Европейский журнал рака. 1995. 31 (4): 453–458. [PubMed] [Google Scholar]
  • Cheung Y-T, Lau WK-W и др. Эффекты полностью транс-ретиноевой кислоты на нейробластому человека SH-SY5Y в качестве модели in vitro в исследовании нейротоксичности. Нейротоксикология. 2009. 30 (1): 127–135. [PubMed] [Google Scholar]
  • Агхолм Л., Линдстрём Т., Когедал К., Маркуссон Дж., Холлбек М. Модель нейробиологии in vitro: дифференциация клеток SH-SY5Y в клетки с морфологическими и биохимическими характеристиками зрелых нейронов.Журнал болезни Альцгеймера: JAD. 2010. 20 (4): 1069–1082. [PubMed] [Google Scholar]
  • La Monica N, Racaniello VR. Различия в репликации аттенуированных и нейровирулентных полиовирусов в линии клеток нейробластомы человека SH-SY5Y. Журнал вирусологии. 1989. 63 (5): 2357–2360. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Cordey S, Petty TJ, et al. Идентификация сайт-специфических адаптаций, вызывающих повышенный тропизм нервных клеток во время инфицирования энтеровирусом человека 71. PLoS Pathog.2012; 8 (7): e1002826. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Xu L-J, Jiang T, et al. Глобальный транскриптомный анализ клеток нейробластомы человека в ответ на инфекцию энтеровирусом 71 типа. PLoS ONE. 2013; 8 (7): e65948. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Luo MH, Fortunato EA. Длительная инфекция и выделение цитомегаловируса человека в клетках глиобластомы T98G. Журнал вирусологии. 2007. 81 (19): 10424–10436. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Sun Z, Yang H, Shi Y, Wei M, Xian J, Hu W.Создание системы модели клеток латентной инфекции вируса простого герпеса II типа и реактивация в клетках SH-SY5Y. Вэй Шэн Ву Сюэ Бао = Acta Microbiologica Sinica. 2010. 50 (1): 98–106. [PubMed] [Google Scholar]
  • Юн С.-И, Сон Би-Х и др. Молекулярно клонированный живой аттенуированный вирус японского энцефалита для вакцины SA14-14-2: консервативная единственная аминокислота в шпильке ij гликопротеина вируса E определяет нейровирулентность у мышей. Патогены PLoS. 2014; 10 (7): e1004290. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Гаррити-Моисей М.Э., Дэн Кью, Лю Дж., Танасе Д., Булис Н.М.Нейропротективный перенос гена Bcl-xL аденоассоциированного вируса в моделях болезни двигательных нейронов. Мышцы и нервы. 2005. 32 (6): 734–744. [PubMed] [Google Scholar]
  • Калия М., Хаса Р., Шарма М., Наин М., Врати С. Вирус японского энцефалита заражает нейрональные клетки посредством независимого от клатрина эндоцитарного механизма. Журнал вирусологии. 2013. 87 (1): 148–162. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Haedicke J, Brown C, Naghavi MH. Специфический для мозга фактор FEZ1 является определяющим фактором восприимчивости нейронов к инфекции ВИЧ-1.Труды Национальной академии наук. 2009. 106 (33): 14040–14045. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Xu K, Liu X-N и др. ВПГ-1 с дефектом репликации эффективно воздействует на ганглии тройничного нерва и подавляет вирусный патопоэз, опосредуя экспрессию гамма-интерферона в клетках SH-SY5Y. Журнал молекулярной нейробиологии: МН. 2014. 53 (1): 78–86. [PubMed] [Google Scholar]
  • О Дж, Фрейзер Н.В. Временная ассоциация генома вируса простого герпеса с гистоновыми белками во время литической инфекции.Журнал вирусологии. 2008. 82 (7): 3530–3537. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Stiles KM, Milne RSB, Cohen GH, Eisenberg RJ, Krummenacher C.Рецептор нектина-1 вируса простого герпеса подавляется после транс-взаимодействия с гликопротеином D. Вирусология . 2008. 373 (1): 98–111. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Thomas DL, Lock M, Zabolotny JM, Mohan BR, Fraser NW. 2-килобазный интрон латентного транскрипта вируса простого герпеса типа 1 имеет период полужизни приблизительно 24 часа в клетках SY5Y и COS-1.Журнал вирусологии. 2002. 76 (2): 532–540. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Handler CG, Cohen GH, Eisenberg RJ. Поперечное сшивание олигомеров гликопротеина во время проникновения вируса простого герпеса 1 типа. Журнал вирусологии. 1996. 70 (9): 6076–6082. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Никола А.В., Хоу Дж., Майор Е.О., Straus SE. Вирус простого герпеса типа 1 проникает в эпидермальные кератиноциты человека, но не в нейроны, через pH-зависимый эндоцитарный путь. Журнал вирусологии. 2005. 79 (12): 7609–7616.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Korecka JA, van Kesteren RE, et al. Фенотипическая характеристика дифференцированных ретиноевой кислотой клеток SH-SY5Y с помощью транскрипционного профилирования. PloS One. 2013; 8 (5): e63862. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Presgraves SP, Ahmed T, Borwege S, Joyce JN. Терминально дифференцированные клетки SH-SY5Y представляют собой модельную систему для изучения нейрозащитных эффектов агонистов дофамина. Исследование нейротоксичности. 2004. 5 (8): 579–598. [PubMed] [Google Scholar]
  • Цяо Дж., Пол П. и др.PI3K / AKT и ERK регулируют индуцированную ретиноевой кислотой клеточную дифференцировку нейробластомы. Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях. 2012. 424 (3): 421–426. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Рекомендации по использованию клеток нейробластомы SH-SY5Y в нейробиологии

Abstract

Использование первичных нейронов млекопитающих, полученных из эмбриональной ткани центральной нервной системы, ограничено тем фактом, что которые однажды окончательно дифференцировались в зрелые нейроны, клетки больше не могут размножаться.Трансформированные нейроноподобные клеточные линии можно использовать in vitro для преодоления этого ограничения. Однако существует несколько предостережений при использовании клеток, полученных из злокачественных опухолей. В этом контексте описывается популярная линия клеток нейробластомы SH-SY5Y и ее использование в системах in vitro. Первоначально полученные в результате биопсии метастатической костной опухоли, клетки SH-SY5Y (ATCC ® CRL-2266 ™) являются сублинией родительской линии SK-N-SH (ATCC ® HTB-11 ™). SK-N-SH были субклонированы трижды; сначала на SH-SY , затем на SH-SY5 и, наконец, на SH-SY5Y . SH-SY5Y были депонированы в ATCC ® в 1970 году Джун Л. Бидлер.

При использовании этих клеток в исследованиях in vitro необходимо учитывать три важных характеристики клеток SH-SY5Y . Во-первых, культуры включают как прикрепленные, так и плавающие клетки, оба типа которых являются жизнеспособными. В нескольких исследованиях рассматривается биологическое значение фенотипов адгезивных и плавающих, но в большинстве опубликованных исследований используются адгезивные популяции и отбрасываются плавающие клетки во время смены среды.Во-вторых, ранние исследования группы Бидлера показали, что родительские дифференцированные клетки SK-N-SH содержат два морфологически различных фенотипа: нейробластоподобные клетки и эпителиоподобные клетки (Ross et al., J Nat Cancer Inst 71: 741-747 , 1983). Эти два фенотипа могут соответствовать типам «N» и «S», описанным в более поздних исследованиях в SH-SY5Y Encinas et al. (J Neurochem 75: 991–1003, 2000). Клетки с нейробластоподобной морфологией положительны в отношении тирозингидроксилазы (TH) и дофамин-β-гидроксилазы, характерных для катехоламинергических нейронов, тогда как эпителиоподобные аналогичные клетки лишены этой ферментативной активности (Ross et al., J Nat Cancer Inst 71: 741–747, 1983). В-третьих, клетки SH-SY5Y можно дифференцировать до более зрелого нейроноподобного фенотипа, который характеризуется нейрональными маркерами. Существует несколько методов дифференциации клеток SH-SY5Y , которые упомянуты ниже. Ретиноевая кислота – это наиболее часто используемое средство для дифференциации, и мы рассмотрим его подробнее.

Ключевые слова: Нейробластома, дифференциация, нейрон

1 Введение

1.1 Предисловие

Подробный отчет Biedler et al.в 1978 г. описаны исходные условия культивирования клеток SH-SY5Y [3], а модифицированная версия этого протокола представлена ​​в подзаголовке 3 этой главы. Вкратце, клетки SK-N-SH и производные клоны, включая SH-SY5Y , высевают с плотностью 2 × 10 5 или 4 × 10 6 клеток / чашку 60 мм в минимально необходимой среде Игла с добавками. с заменителями аминокислот, 15% фетальной бычьей сыворотки, пенициллин (100 МЕ / мл) и стрептомицин (100 мкг / мл).Эти исходные плотности покрытия использовали для определения времени удвоения и плотности насыщения. Хотя время удвоения SH-SY5Y конкретно не сообщалось, у родительских нейробластоподобных популяций время удвоения составляет приблизительно 27 ч, а субклоны, как сообщается, имеют аналогичное время удвоения. Сообщается, что клетки SH-SY5Y имеют плотность насыщения роста> 1 × 10 6 клеток / см 2 . В этом исследовании при прохождении клеток собирали как прикрепленные, так и плавающие клетки.Плавающие клетки удаляли в культуральной среде, а прилипшие клетки отделяли трипсином. Две популяции клеток были объединены, центрифугированы и повторно посеяны при подходящей плотности. Объединение суспендированных и прикрепленных клеток может стать важным аспектом во время протоколов дифференцировки и будет обсуждаться в следующих разделах. Клетки выращивают в увлажненной камере с 5% CO 2 при 37 ° C. В отношении нормальных условий культивирования клеток SH-SY5Y за последние четыре десятилетия мало что изменилось.Эти ранние исследования также касались свойств передатчика и показали, что SH-SY5Y состоит из гомогенных нейробластоподобных популяций. Анализ специфической активности нейронных ферментов в клетках и клонах SK-N-SH показал уровни дофамин-β-гидроксилазы 3,74 нмоль / ч / мг в клетках SH-SH5Y , хотя был проанализирован только один набор культур клеток [3 ]. Уровни холинацетилтрансферазы, ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы были незначительными в SK-N-SH и его клонах, включая SH-SY5Y .

1.2 Недифференцированные и дифференцированные клетки SH-SY5Y

Способность исследователей дифференцировать клетки нейробластомы SH-SY5Y в клетки, обладающие более зрелым нейроноподобным фенотипом, посредством манипуляции с культуральной средой, дала многочисленные преимущества в области нейробиологические исследования. Преимущества включают способность к крупномасштабной экспансии до дифференциации, относительную простоту и низкую стоимость культивирования по сравнению с первичными нейронами. Поскольку эти клетки считаются клеточной линией, этические проблемы, связанные с первичной культурой нейронов человека, не рассматриваются.Кроме того, поскольку клетки SH-SY5Y происходят от человека, они экспрессируют ряд специфичных для человека белков и изоформ белков, которые по своей природе не присутствуют в первичных культурах грызунов. Кроме того, дифференцировка синхронизирует клеточный цикл, который может резко колебаться в недифференцированных клетках SH-SY5Y и других обычно используемых клеточных линиях, чтобы произвести гомогенную популяцию нейрональных клеток [1, 2].

Как недифференцированные, так и дифференцированные клетки SH-SY5Y были использованы для экспериментов in vitro, требующих нейроноподобных клеток.Дифференцировка нейронов влечет за собой ряд специфических событий, включая формирование и распространение нейритных процессов, повышение электрической возбудимости плазматической мембраны, образование синаптофизин-положительных функциональных синапсов и индукцию нейрон-специфических ферментов, нейротрансмиттеров и рецепторов нейротрансмиттеров [4-8 ]. Таким образом, при определении того, следует ли использовать недифференцированные или дифференцированные клетки для конкретного эксперимента, следует принимать во внимание все эти свойства.

В недифференцированной форме клетки SH-SY5Y морфологически характеризуются нейробластоподобными неполяризованными клеточными телами с небольшим количеством усеченных отростков. Клетки имеют тенденцию расти кластерами и могут образовывать сгустки, поскольку кажется, что клетки растут друг над другом в центральной области клеточной массы (). Аналогичным образом, культуры содержат как прикрепленные, так и плавающие клетки, и некоторые исследования показывают, что плавающие клетки с большей вероятностью прилипают и дифференцируются в клетки типа «N» при RA-дифференцировке, чем прилипшие клетки, присутствующие в недифференцированных культурах.Недифференцированные клетки SH-SY5Y непрерывно пролиферируют, экспрессируют незрелые нейрональные маркеры и не имеют зрелых нейрональных маркеров [6]. Считается, что недифференцированные клетки больше всего напоминают незрелые катехоламинергические нейроны [7, 9]. После обработки агентами, индуцирующими дифференцировку, клетки SH-SY5Y становятся морфологически более похожими на первичные нейроны с длинными изящными отростками [6] (). Зрелые клетки могут проявлять многочисленные, но случайно распределенные процессы или становиться отчетливо поляризованными, в зависимости от метода индукции дифференцировки.Дифференциация клеток SH-SY5Y также вызывает снижение скорости пролиферации, поскольку клетки выводятся из клеточного цикла, и повышение активности нейронспецифической энолазы (NSE), доминирующего изофермента энолазы, присутствующего в нейрональных и нейроэндокринных тканях. [2, 6]. Существует ряд методов индукции дифференцировки клеток SH-SY5Y , которые упомянуты ниже. SH-SY5Y Клетки могут приводить к развитию различных фенотипов взрослых нейронов, включая холинергические, адренергические или дофаминергические, в зависимости от условий среды [9].Метод дифференциации, выбранный для экспериментов in vitro, должен в конечном итоге определяться желаемым фенотипом после дифференциации, а также снижением нецелевых эффектов на рассматриваемые экспериментальные пути с помощью конкретных дифференцирующих агентов.

Недифференцированные клетки SH-SY5Y . Клетки имеют тенденцию расти группами и могут образовывать скопления округлых ячеек друг над другом (стрелка ) . По краям кластера клетки начинают вытягивать короткие нейриты ( стрелка, )

Дифференцированные SH-SY5Y клетки.Клетки не группируются и имеют более пирамидальную форму тела клетки ( стрелка, ). Нейриты начинают разрастаться, напоминая дендриты и / или аксоны

1.3 Ретиноевая кислота

Одним из наиболее часто применяемых и наиболее охарактеризованных методов индукции дифференцировки в клетках SH-SY5Y является добавление ретиноевой кислоты (RA) в среду для культивирования клеток. Ретиноевая кислота – это производное витамина А, которое, как известно, обладает мощными свойствами ингибировать рост и способствовать дифференцировке клеток [10, 11].Фактически, дефицит витамина А связан с развитием плоской метаплазии в различных эпителиальных тканях, тогда как введение витамина А может обратить эти эффекты и восстановить нормальную клеточную дифференцировку [10, 11]. Обычно RA вводят в концентрации 10 мкМ в течение минимум 3-5 дней в бессывороточной среде или среде с низким содержанием сыворотки, чтобы вызвать дифференцировку [6, 12], хотя сообщается о небольших вариациях в средах.

Обработка ретиноевой кислотой, как было показано, способствует выживанию клеток SH-SY5Y за счет активации пути передачи сигналов фосфатидилинозитол-3-киназа / Akt и активации антиапоптотического белка Bcl-2 [13, 14].Кроме того, некоторые исследования показывают, что RA-дифференцированные клетки менее уязвимы, чем недифференцированные клетки, к токсин-опосредованной гибели клеток, вызванной такими агентами, как 6-гидроксидофамин (6-OHDA), 1-метил-4-фенил-1,2,3,6 -тетрагидропиридин (MPTP) или его метаболит, ион 1-метил-4-фенилпиридиния (MPP + ), чем недифференцированные клетки [12].

SH-SY5Y клетки дифференцируются в первую очередь по фенотипу холинергических нейронов в ответ на лечение RA, о чем свидетельствует повышенная экспрессия активности холинацетилтрансферазы (ChAT) и экспрессия везикулярного транспортера монамина (VMAT) [7, 15].Клетки также могут быть доведены до зрелого дофаминергического фенотипа при лечении RA, но для этого обычно требуется совместное введение дополнительных агентов, таких как сложные эфиры форбола [15]. В то время как в литературе существуют разногласия относительно того, значительно ли увеличивается количество дофаминергических маркеров в недифференцированных клетках SH-SY5Y во время индуцированной RA дифференцировки, исследования демонстрируют устойчивое увеличение тирозингидроксилазы (TH), подтипов дофаминовых рецепторов 2 и 3 (D2R и D3R). и экспрессия переносчика дофамина (DAT), когда за введением RA следует обработка сложными эфирами форбола [15].Интересно, что Encinas et al. сообщили в 2000 году, что RA-дифференцированные клетки SH-SY5Y ответили на стимуляцию карбахолом повышенным высвобождением норадреналина [2]

1,4 сложных эфиров форбола

В дополнение к RA-опосредованной дифференцировке было показано, что клетки SH-SY5Y способны дифференцируются в присутствии сложных эфиров форбола, таких как 12- O -тетрадеканоил-форбол-13 ацетат (TPA) [5]. В 1981 году Полман и др. продемонстрировали, что клетки SH-SY5Y , подвергшиеся воздействию 1.6 × 10 −8 M TPA в течение 4 дней оказались морфологически дифференцированными с длинными прямыми отростками неравномерной формы и частым варикозным расширением вен [5]. Обработка TPA также приводила к частичному подавлению роста, примерно двукратному увеличению активности NSE и появлению цитоплазматических нейросекреторных гранул, которые можно визуализировать с помощью электронной микроскопии [5, 6]. Одно поразительное различие между TPA- и RA-индуцированной дифференцировкой клеток SH-SY5Y состоит в том, что обработка TPA увеличивает содержание норадреналина в клетках до 200 раз, в то время как лечение RA вызывает приблизительно четырехкратную индукцию норадреналина [6].Следовательно, использование TPA для индукции дифференцировки клеток SH-SY5Y дает преимущественно адренергический клеточный фенотип [16, 17].

1,5 Дибутирилциклический АМФ

Гормоны и нейротрансмиттеры, которые повышают внутриклеточные уровни циклического АМФ (цАМФ), способствуют дифференцировке и долгосрочному усилению нейрональных клеток [18, 19]. Воздействие на клетки SH-SY5Y дибутирилциклического АМФ (dbcAMP) приводит к удлинению нейритов, а также к повышенной экспрессии зрелого нейронального маркера роста-ассоциированного белка 43 (GAP43) [19, 20].Исследования показывают, что обработка 1 мМ dbcAMP в течение 3 дней снижает агрегацию клеток, напоминающую агрегацию, обычно наблюдаемую в недифференцированных культурах (), и вызывает значительное удлинение и ветвление нейритов [20]. Воздействие dbcAMP также приводит к значительному увеличению иммунореактивности тирозингидроксилазы (TH) и клеточного содержания норадреналина зависимым от протеинкиназы A (PKA) образом [14, 20]. По сравнению с обработкой RA и TPA, которые увеличивают экспрессию Bcl-2, dbcAMP снижает Bcl-2, подчеркивая одно биохимическое различие между методами дифференциации.Эти исследования показывают, что дифференцировка клеток SH-SY5Y с dbcAMP дает морфологический фенотип, сходный с фенотипом, наблюдаемым у RA и TPA-дифференцированных клеток, и что дифференцированная культура состоит в основном из адренергических нейроноподобных клеток.

1.6 Дополнительные методы дифференцировки

Также был описан ряд менее распространенных альтернативных методов индукции дифференцировки в клетках SH-SY5Y . Стауроспорин, ингибитор ПКС, запускает нейритогенез и остановку клеточного цикла в клетках SH-SY5Y [21, 22].Однако, в отличие от клеток, дифференцированных с помощью RA, обработанные стауроспорином клетки проявляют повышенную уязвимость к токсическим воздействиям, включая цисплатин, 5-фторурацил, 6-OHDA и γ-излучение, и экспрессируют пониженные уровни Bcl-2 [22]. Следовательно, клетки, обработанные стауроспорином, подвергаются апоптозу дозозависимым образом. Было показано, что помимо стауроспорина лечение факторами роста, такими как фактор роста нервов (NGF) и нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), поддерживает дифференцировку и поддержание фенотипа зрелых нейронов, особенно при использовании в сочетании с RA или TPA. лечение [2, 23, 24].Аналогичным образом было показано, что культивирование клеток SH-SY5Y в нейробазальной среде с добавкой B27, условия, обычно используемые для первичной культуры нейронов, усиливают дифференцировку [25]. Другие методы включают лечение холестерином, витамином D или инсулином или культивирование клеток на субстрате, предназначенном для стимуляции дифференцировки и выживания нейронов [26–29]. Опять же, выбор подходящего агента индукции дифференциации следует тщательно оценивать в зависимости от возможности последующих, непредвиденных воздействий на показатели выхода, вызванных одной только обработкой.

1,7 Маркеры для дифференцировки

Недифференцированные клетки SH-SY5Y обычно напоминают незрелые катехоламинергические нейроны. Они характеризуются маркерами, указывающими на пролиферацию, такими как ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), а также маркерами незрелых нейронов, такими как нестин [7, 30]. Недифференцированные клетки также экспрессируют ингибирующие дифференцировку основные факторы транскрипции спираль-петля-спираль ID1, ID2 и ID3, все из которых значительно снижаются после лечения RA или TPA [13].После дифференцировки клетки SH-SY5Y экспрессируют ряд зрелых нейрональных маркеров, включая βIII-тубулин, белок-2, связанный с микротрубочками (MAP2), синаптофизин, NeuN, синаптически связанный белок-97 (SAP-97) и NSE [ 7, 12]. Кроме того, экспрессия генов, способствующих дифференцировке NEUROD6 и NEUROD1 , увеличивается после лечения RA [13]. Дифференциация клеток SH-SY5Y может привести к относительно однородной популяции нейроноподобных клеток на стадии G0, которые обнаруживают отсутствие маркеров для других типов клеток ЦНС, таких как астроцитарный маркер глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) [2, 11], но следует проявлять осторожность при оценке пролиферации клеток, у которых отсутствует нейроноподобный фенотип, как обсуждается ниже.

В многочисленных отчетах конкретно рассматривались методы получения нейроноподобных клеток из недифференцированных SH-SY5Y . Некоторые отчеты предлагают использовать только плавающие клетки в протоколах дифференцировки, в то время как другие рекомендуют использовать только прикрепленные клетки для дифференциации. Подробное описание RA-дифференцированных, поддерживаемых BDNF клеток SH-SY5Y было опубликовано в 2000 году Encinas et al. [2]. В этих исследованиях авторы классифицируют недифференцированные клетки либо как S-тип (адгезивный к субстрату) без нейроноподобного фенотипа, либо как N-тип (нейробластический), характеризующийся невритными процессами ().В исследовании Encinas клетки высевали при 10 4 клеток / см 2 на покрытые коллагеном (0,05 мг / мл) планшеты в DMEM с 2 мМ l-глутамином, пенициллином (20 МЕ / мл), стрептомицином ( 20 мг / мл) и 15% FBS. Сообщалось, что при дифференцировке 10 мкм all- trans -RA в течение 5 дней клетки N-типа приобретали нейроноподобные характеристики с большей готовностью, чем клетки S-типа. Однако на 10-й день после РА процент клеток S-типа в культуре увеличился, и культуры зарастали популяцией S-типа.Таким образом, краткосрочное лечение РА (до 5 дней), по-видимому, индуцировало дифференцировку клеток N-типа, но более длительное лечение (> 10 дней) способствовало пролиферации клеток S-типа, тем самым способствуя несбалансированному соотношению клеток S-типа к клеткам N-типа. Основываясь на таких результатах, при планировании экспериментов in vitro следует учитывать не только количество пассажей, но и фенотип клеток в культуре. Одно из возможных решений для предотвращения дисбаланса, рекомендованное Encinas et al. представляет собой добавление 50 нг / мл BDNF к обработанным RA культурам, поскольку, как сообщается, RA индуцирует рецепторы TrkB на SH-SY5Y клетках с максимальной экспрессией через 5 дней после воздействия BDNF.Удаление сыворотки в сочетании с обработкой BDNF рекомендуется для предотвращения репликации клеток S-типа. Включение сыворотки во время лечения RA-BDNF может способствовать пролиферации S-типа, которая наблюдается в виде монослоя S-клеток под дифференцирующимися клетками N-типа. Культуры, поддерживаемые в бессывороточных условиях с добавлением BDNF, были стабильными до 3 недель без чрезмерного роста клеток S-типа с минимальным апоптозом клеток, как определено с помощью анализа TUNEL и биохимических анализов. С помощью BDNF клетки задерживаются, но удаление BDNF побуждает клетки вступать в S-фазу клеточного цикла [2].

Популяции дифференцированных клеток состоят из двух морфологически различных типов: «S» и «N». Клетка типа «S» похожа на эпителий без отростков ( стрелки ), тогда как тип «N» более похож на нейроны с телами пирамидальной формы ( звездочка ) и длинными отростками ( стрелок )

Нейроны Маркерную экспрессию культур, подвергшихся воздействию RA, BDNF и бессывороточных условиях, оценивали с помощью иммуноцитохимии и вестерн-анализов. В этих исследованиях ни необработанные, ни обработанные RA-BDNF клетки SH-SHY5Y не экспрессировали GFAP, но NSE был обнаружен во всех условиях.С другой стороны, нейрофиламенты средней и высокой молекулярной массы были обнаружены в необработанных и обработанных 5-дневным RA нейронах, но исчезли после добавления BDNF. Экспрессия GAP-43 увеличивалась после 5 дней лечения RA с последующим 1 днем ​​лечения BDNF. Однако продолжение лечения BDNF в течение 3–9 дней привело к возвращению уровней GAP-43 к исходному уровню. Авт. Предполагают, что этот профиль экспрессии совпадает с высокими уровнями расширения нейритов, во время которых необходим GAP-43. Однако удаление RA из среды, содержащей BDNF, также могло внести свой вклад.

1.8 Маркеры рецепторов / транспортеров

1.8.1 Дофаминергические нейроны

SH-SY5Y Клетки как в недифференцированном, так и в дифференцированном состоянии экспрессируют ряд дофаминергических нейрональных маркеров. Эти клетки экспрессируют TH, фермент, критически важный для катализа дофамина и, далее, норадреналина (норадреналина) и адреналина (адреналина) [20]. Важно отметить, что клетки SH-SY5Y также экспрессируют переносчик дофамина (DAT), а также подтипы 2 и 3 дофаминовых рецепторов (D2R и D3R), что делает их образцовой системой in vitro для исследования нейротоксичности в дофаминергических нейронах, а также для лекарств, которые, как известно, оказывают первичное действие за счет активации дофаминовых рецепторов [31].Экспрессия TH, DAT, D2R и D3R, как было показано, увеличивается после дифференцировки в ряде исследований, особенно когда комбинация RA и TPA используется для индукции дифференцировки [7, 15, 32]. Однако существует также масса литературы, в которой не сообщается о значительной разнице в уровнях TH или DAT после дифференцировки, хотя в этих исследованиях обычно использовался только RA или агенты, которые способствуют недофаминергическому фенотипу для индукции дифференцировки [12, 33].

1.8.2 Адренергические нейроны

Клетки SH-SY5Y могут приводить к адренергическому фенотипу посредством RA- или TPA-индуцированной дифференцировки. Опять же, требуется экспрессия TH, поскольку нор-адреналин и адреналин являются производными дофамина, катализируемыми TH-зависимым образом [20]. Исследования показывают, что как дифференцированные, так и недифференцированные клетки SH-SY5Y с большим числом пассажей экспрессируют достаточные уровни дофамин-β-гидроксилазы, фермента, который катализирует образование нор-адреналина из дофамина, и способны превращать внутриклеточный дофамин в нор-адреналин. (нор-адреналин).Кроме того, клетки SH-SY5Y экспрессируют транспортер норадреналина (NET) и транспортер везикулярных моноаминов (VMAT), характерные для адренергических нейронов.

1.8.3 Холинергические нейроны

Об экспрессии мускариновых и никотиновых рецепторов ацетилхолина сообщалось в клетках SH-SY5Y . Мускариновые рецепторы, связанные с G-белком, присутствуют на мембранах как недифференцированных, так и дифференцированных клеток, хотя уровни и связывающие свойства по-разному регулируются в соответствии с методом дифференцировки.Например, лечение TPA уменьшается, тогда как лечение RA увеличивает количество сайтов связывания мускаринов [4]. Клетки, обработанные как TPA, так и RA, демонстрируют значительно повышенную активность ацетилхолинэстеразы по сравнению с недифференцированными клетками. Однако было показано, что только лечение РА увеличивает активность холинацетилтрансферазы [4]. Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы с управляемым лигандом ионным каналом (nAChR) также присутствуют в клетках SH-SY5Y и считаются аналогами nAChR ганглиозного типа человека [34, 35].Было показано, что nAChR на SH-SY5Y клетках десенсибилизирует в ответ на никотин, но восстанавливает полную чувствительность после вымывания, аналогично тому, что, как известно, происходит в первичных нейронах после активации рецептора [36].

Рекомендации по использованию клеток нейробластомы SH-SY5Y в нейробиологии

Abstract

Использование первичных нейронов млекопитающих, происходящих из эмбриональной ткани центральной нервной системы, ограничено тем фактом, что после окончательной дифференцировки в зрелые нейроны клетки больше не могут размножаться.Трансформированные нейроноподобные клеточные линии можно использовать in vitro для преодоления этого ограничения. Однако существует несколько предостережений при использовании клеток, полученных из злокачественных опухолей. В этом контексте описывается популярная линия клеток нейробластомы SH-SY5Y и ее использование в системах in vitro. Первоначально полученные в результате биопсии метастатической костной опухоли, клетки SH-SY5Y (ATCC ® CRL-2266 ™) являются сублинией родительской линии SK-N-SH (ATCC ® HTB-11 ™). SK-N-SH были субклонированы трижды; сначала на SH-SY , затем на SH-SY5 и, наконец, на SH-SY5Y . SH-SY5Y были депонированы в ATCC ® в 1970 году Джун Л. Бидлер.

При использовании этих клеток в исследованиях in vitro необходимо учитывать три важных характеристики клеток SH-SY5Y . Во-первых, культуры включают как прикрепленные, так и плавающие клетки, оба типа которых являются жизнеспособными. В нескольких исследованиях рассматривается биологическое значение фенотипов адгезивных и плавающих, но в большинстве опубликованных исследований используются адгезивные популяции и отбрасываются плавающие клетки во время смены среды.Во-вторых, ранние исследования группы Бидлера показали, что родительские дифференцированные клетки SK-N-SH содержат два морфологически различных фенотипа: нейробластоподобные клетки и эпителиоподобные клетки (Ross et al., J Nat Cancer Inst 71: 741-747 , 1983). Эти два фенотипа могут соответствовать типам «N» и «S», описанным в более поздних исследованиях в SH-SY5Y Encinas et al. (J Neurochem 75: 991–1003, 2000). Клетки с нейробластоподобной морфологией положительны в отношении тирозингидроксилазы (TH) и дофамин-β-гидроксилазы, характерных для катехоламинергических нейронов, тогда как эпителиоподобные аналогичные клетки лишены этой ферментативной активности (Ross et al., J Nat Cancer Inst 71: 741–747, 1983). В-третьих, клетки SH-SY5Y можно дифференцировать до более зрелого нейроноподобного фенотипа, который характеризуется нейрональными маркерами. Существует несколько методов дифференциации клеток SH-SY5Y , которые упомянуты ниже. Ретиноевая кислота – это наиболее часто используемое средство для дифференциации, и мы рассмотрим его подробнее.

Ключевые слова: Нейробластома, дифференциация, нейрон

1 Введение

1.1 Предисловие

Подробный отчет Biedler et al.в 1978 г. описаны исходные условия культивирования клеток SH-SY5Y [3], а модифицированная версия этого протокола представлена ​​в подзаголовке 3 этой главы. Вкратце, клетки SK-N-SH и производные клоны, включая SH-SY5Y , высевают с плотностью 2 × 10 5 или 4 × 10 6 клеток / чашку 60 мм в минимально необходимой среде Игла с добавками. с заменителями аминокислот, 15% фетальной бычьей сыворотки, пенициллин (100 МЕ / мл) и стрептомицин (100 мкг / мл).Эти исходные плотности покрытия использовали для определения времени удвоения и плотности насыщения. Хотя время удвоения SH-SY5Y конкретно не сообщалось, у родительских нейробластоподобных популяций время удвоения составляет приблизительно 27 ч, а субклоны, как сообщается, имеют аналогичное время удвоения. Сообщается, что клетки SH-SY5Y имеют плотность насыщения роста> 1 × 10 6 клеток / см 2 . В этом исследовании при прохождении клеток собирали как прикрепленные, так и плавающие клетки.Плавающие клетки удаляли в культуральной среде, а прилипшие клетки отделяли трипсином. Две популяции клеток были объединены, центрифугированы и повторно посеяны при подходящей плотности. Объединение суспендированных и прикрепленных клеток может стать важным аспектом во время протоколов дифференцировки и будет обсуждаться в следующих разделах. Клетки выращивают в увлажненной камере с 5% CO 2 при 37 ° C. В отношении нормальных условий культивирования клеток SH-SY5Y за последние четыре десятилетия мало что изменилось.Эти ранние исследования также касались свойств передатчика и показали, что SH-SY5Y состоит из гомогенных нейробластоподобных популяций. Анализ специфической активности нейронных ферментов в клетках и клонах SK-N-SH показал уровни дофамин-β-гидроксилазы 3,74 нмоль / ч / мг в клетках SH-SH5Y , хотя был проанализирован только один набор культур клеток [3 ]. Уровни холинацетилтрансферазы, ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы были незначительными в SK-N-SH и его клонах, включая SH-SY5Y .

1.2 Недифференцированные и дифференцированные клетки SH-SY5Y

Способность исследователей дифференцировать клетки нейробластомы SH-SY5Y в клетки, обладающие более зрелым нейроноподобным фенотипом, посредством манипуляции с культуральной средой, дала многочисленные преимущества в области нейробиологические исследования. Преимущества включают способность к крупномасштабной экспансии до дифференциации, относительную простоту и низкую стоимость культивирования по сравнению с первичными нейронами. Поскольку эти клетки считаются клеточной линией, этические проблемы, связанные с первичной культурой нейронов человека, не рассматриваются.Кроме того, поскольку клетки SH-SY5Y происходят от человека, они экспрессируют ряд специфичных для человека белков и изоформ белков, которые по своей природе не присутствуют в первичных культурах грызунов. Кроме того, дифференцировка синхронизирует клеточный цикл, который может резко колебаться в недифференцированных клетках SH-SY5Y и других обычно используемых клеточных линиях, чтобы произвести гомогенную популяцию нейрональных клеток [1, 2].

Как недифференцированные, так и дифференцированные клетки SH-SY5Y были использованы для экспериментов in vitro, требующих нейроноподобных клеток.Дифференцировка нейронов влечет за собой ряд специфических событий, включая формирование и распространение нейритных процессов, повышение электрической возбудимости плазматической мембраны, образование синаптофизин-положительных функциональных синапсов и индукцию нейрон-специфических ферментов, нейротрансмиттеров и рецепторов нейротрансмиттеров [4-8 ]. Таким образом, при определении того, следует ли использовать недифференцированные или дифференцированные клетки для конкретного эксперимента, следует принимать во внимание все эти свойства.

В недифференцированной форме клетки SH-SY5Y морфологически характеризуются нейробластоподобными неполяризованными клеточными телами с небольшим количеством усеченных отростков. Клетки имеют тенденцию расти кластерами и могут образовывать сгустки, поскольку кажется, что клетки растут друг над другом в центральной области клеточной массы (). Аналогичным образом, культуры содержат как прикрепленные, так и плавающие клетки, и некоторые исследования показывают, что плавающие клетки с большей вероятностью прилипают и дифференцируются в клетки типа «N» при RA-дифференцировке, чем прилипшие клетки, присутствующие в недифференцированных культурах.Недифференцированные клетки SH-SY5Y непрерывно пролиферируют, экспрессируют незрелые нейрональные маркеры и не имеют зрелых нейрональных маркеров [6]. Считается, что недифференцированные клетки больше всего напоминают незрелые катехоламинергические нейроны [7, 9]. После обработки агентами, индуцирующими дифференцировку, клетки SH-SY5Y становятся морфологически более похожими на первичные нейроны с длинными изящными отростками [6] (). Зрелые клетки могут проявлять многочисленные, но случайно распределенные процессы или становиться отчетливо поляризованными, в зависимости от метода индукции дифференцировки.Дифференциация клеток SH-SY5Y также вызывает снижение скорости пролиферации, поскольку клетки выводятся из клеточного цикла, и повышение активности нейронспецифической энолазы (NSE), доминирующего изофермента энолазы, присутствующего в нейрональных и нейроэндокринных тканях. [2, 6]. Существует ряд методов индукции дифференцировки клеток SH-SY5Y , которые упомянуты ниже. SH-SY5Y Клетки могут приводить к развитию различных фенотипов взрослых нейронов, включая холинергические, адренергические или дофаминергические, в зависимости от условий среды [9].Метод дифференциации, выбранный для экспериментов in vitro, должен в конечном итоге определяться желаемым фенотипом после дифференциации, а также снижением нецелевых эффектов на рассматриваемые экспериментальные пути с помощью конкретных дифференцирующих агентов.

Недифференцированные клетки SH-SY5Y . Клетки имеют тенденцию расти группами и могут образовывать скопления округлых ячеек друг над другом (стрелка ) . По краям кластера клетки начинают вытягивать короткие нейриты ( стрелка, )

Дифференцированные SH-SY5Y клетки.Клетки не группируются и имеют более пирамидальную форму тела клетки ( стрелка, ). Нейриты начинают разрастаться, напоминая дендриты и / или аксоны

1.3 Ретиноевая кислота

Одним из наиболее часто применяемых и наиболее охарактеризованных методов индукции дифференцировки в клетках SH-SY5Y является добавление ретиноевой кислоты (RA) в среду для культивирования клеток. Ретиноевая кислота – это производное витамина А, которое, как известно, обладает мощными свойствами ингибировать рост и способствовать дифференцировке клеток [10, 11].Фактически, дефицит витамина А связан с развитием плоской метаплазии в различных эпителиальных тканях, тогда как введение витамина А может обратить эти эффекты и восстановить нормальную клеточную дифференцировку [10, 11]. Обычно RA вводят в концентрации 10 мкМ в течение минимум 3-5 дней в бессывороточной среде или среде с низким содержанием сыворотки, чтобы вызвать дифференцировку [6, 12], хотя сообщается о небольших вариациях в средах.

Обработка ретиноевой кислотой, как было показано, способствует выживанию клеток SH-SY5Y за счет активации пути передачи сигналов фосфатидилинозитол-3-киназа / Akt и активации антиапоптотического белка Bcl-2 [13, 14].Кроме того, некоторые исследования показывают, что RA-дифференцированные клетки менее уязвимы, чем недифференцированные клетки, к токсин-опосредованной гибели клеток, вызванной такими агентами, как 6-гидроксидофамин (6-OHDA), 1-метил-4-фенил-1,2,3,6 -тетрагидропиридин (MPTP) или его метаболит, ион 1-метил-4-фенилпиридиния (MPP + ), чем недифференцированные клетки [12].

SH-SY5Y клетки дифференцируются в первую очередь по фенотипу холинергических нейронов в ответ на лечение RA, о чем свидетельствует повышенная экспрессия активности холинацетилтрансферазы (ChAT) и экспрессия везикулярного транспортера монамина (VMAT) [7, 15].Клетки также могут быть доведены до зрелого дофаминергического фенотипа при лечении RA, но для этого обычно требуется совместное введение дополнительных агентов, таких как сложные эфиры форбола [15]. В то время как в литературе существуют разногласия относительно того, значительно ли увеличивается количество дофаминергических маркеров в недифференцированных клетках SH-SY5Y во время индуцированной RA дифференцировки, исследования демонстрируют устойчивое увеличение тирозингидроксилазы (TH), подтипов дофаминовых рецепторов 2 и 3 (D2R и D3R). и экспрессия переносчика дофамина (DAT), когда за введением RA следует обработка сложными эфирами форбола [15].Интересно, что Encinas et al. сообщили в 2000 году, что RA-дифференцированные клетки SH-SY5Y ответили на стимуляцию карбахолом повышенным высвобождением норадреналина [2]

1,4 сложных эфиров форбола

В дополнение к RA-опосредованной дифференцировке было показано, что клетки SH-SY5Y способны дифференцируются в присутствии сложных эфиров форбола, таких как 12- O -тетрадеканоил-форбол-13 ацетат (TPA) [5]. В 1981 году Полман и др. продемонстрировали, что клетки SH-SY5Y , подвергшиеся воздействию 1.6 × 10 −8 M TPA в течение 4 дней оказались морфологически дифференцированными с длинными прямыми отростками неравномерной формы и частым варикозным расширением вен [5]. Обработка TPA также приводила к частичному подавлению роста, примерно двукратному увеличению активности NSE и появлению цитоплазматических нейросекреторных гранул, которые можно визуализировать с помощью электронной микроскопии [5, 6]. Одно поразительное различие между TPA- и RA-индуцированной дифференцировкой клеток SH-SY5Y состоит в том, что обработка TPA увеличивает содержание норадреналина в клетках до 200 раз, в то время как лечение RA вызывает приблизительно четырехкратную индукцию норадреналина [6].Следовательно, использование TPA для индукции дифференцировки клеток SH-SY5Y дает преимущественно адренергический клеточный фенотип [16, 17].

1,5 Дибутирилциклический АМФ

Гормоны и нейротрансмиттеры, которые повышают внутриклеточные уровни циклического АМФ (цАМФ), способствуют дифференцировке и долгосрочному усилению нейрональных клеток [18, 19]. Воздействие на клетки SH-SY5Y дибутирилциклического АМФ (dbcAMP) приводит к удлинению нейритов, а также к повышенной экспрессии зрелого нейронального маркера роста-ассоциированного белка 43 (GAP43) [19, 20].Исследования показывают, что обработка 1 мМ dbcAMP в течение 3 дней снижает агрегацию клеток, напоминающую агрегацию, обычно наблюдаемую в недифференцированных культурах (), и вызывает значительное удлинение и ветвление нейритов [20]. Воздействие dbcAMP также приводит к значительному увеличению иммунореактивности тирозингидроксилазы (TH) и клеточного содержания норадреналина зависимым от протеинкиназы A (PKA) образом [14, 20]. По сравнению с обработкой RA и TPA, которые увеличивают экспрессию Bcl-2, dbcAMP снижает Bcl-2, подчеркивая одно биохимическое различие между методами дифференциации.Эти исследования показывают, что дифференцировка клеток SH-SY5Y с dbcAMP дает морфологический фенотип, сходный с фенотипом, наблюдаемым у RA и TPA-дифференцированных клеток, и что дифференцированная культура состоит в основном из адренергических нейроноподобных клеток.

1.6 Дополнительные методы дифференцировки

Также был описан ряд менее распространенных альтернативных методов индукции дифференцировки в клетках SH-SY5Y . Стауроспорин, ингибитор ПКС, запускает нейритогенез и остановку клеточного цикла в клетках SH-SY5Y [21, 22].Однако, в отличие от клеток, дифференцированных с помощью RA, обработанные стауроспорином клетки проявляют повышенную уязвимость к токсическим воздействиям, включая цисплатин, 5-фторурацил, 6-OHDA и γ-излучение, и экспрессируют пониженные уровни Bcl-2 [22]. Следовательно, клетки, обработанные стауроспорином, подвергаются апоптозу дозозависимым образом. Было показано, что помимо стауроспорина лечение факторами роста, такими как фактор роста нервов (NGF) и нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), поддерживает дифференцировку и поддержание фенотипа зрелых нейронов, особенно при использовании в сочетании с RA или TPA. лечение [2, 23, 24].Аналогичным образом было показано, что культивирование клеток SH-SY5Y в нейробазальной среде с добавкой B27, условия, обычно используемые для первичной культуры нейронов, усиливают дифференцировку [25]. Другие методы включают лечение холестерином, витамином D или инсулином или культивирование клеток на субстрате, предназначенном для стимуляции дифференцировки и выживания нейронов [26–29]. Опять же, выбор подходящего агента индукции дифференциации следует тщательно оценивать в зависимости от возможности последующих, непредвиденных воздействий на показатели выхода, вызванных одной только обработкой.

1,7 Маркеры для дифференцировки

Недифференцированные клетки SH-SY5Y обычно напоминают незрелые катехоламинергические нейроны. Они характеризуются маркерами, указывающими на пролиферацию, такими как ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), а также маркерами незрелых нейронов, такими как нестин [7, 30]. Недифференцированные клетки также экспрессируют ингибирующие дифференцировку основные факторы транскрипции спираль-петля-спираль ID1, ID2 и ID3, все из которых значительно снижаются после лечения RA или TPA [13].После дифференцировки клетки SH-SY5Y экспрессируют ряд зрелых нейрональных маркеров, включая βIII-тубулин, белок-2, связанный с микротрубочками (MAP2), синаптофизин, NeuN, синаптически связанный белок-97 (SAP-97) и NSE [ 7, 12]. Кроме того, экспрессия генов, способствующих дифференцировке NEUROD6 и NEUROD1 , увеличивается после лечения RA [13]. Дифференциация клеток SH-SY5Y может привести к относительно однородной популяции нейроноподобных клеток на стадии G0, которые обнаруживают отсутствие маркеров для других типов клеток ЦНС, таких как астроцитарный маркер глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) [2, 11], но следует проявлять осторожность при оценке пролиферации клеток, у которых отсутствует нейроноподобный фенотип, как обсуждается ниже.

В многочисленных отчетах конкретно рассматривались методы получения нейроноподобных клеток из недифференцированных SH-SY5Y . Некоторые отчеты предлагают использовать только плавающие клетки в протоколах дифференцировки, в то время как другие рекомендуют использовать только прикрепленные клетки для дифференциации. Подробное описание RA-дифференцированных, поддерживаемых BDNF клеток SH-SY5Y было опубликовано в 2000 году Encinas et al. [2]. В этих исследованиях авторы классифицируют недифференцированные клетки либо как S-тип (адгезивный к субстрату) без нейроноподобного фенотипа, либо как N-тип (нейробластический), характеризующийся невритными процессами ().В исследовании Encinas клетки высевали при 10 4 клеток / см 2 на покрытые коллагеном (0,05 мг / мл) планшеты в DMEM с 2 мМ l-глутамином, пенициллином (20 МЕ / мл), стрептомицином ( 20 мг / мл) и 15% FBS. Сообщалось, что при дифференцировке 10 мкм all- trans -RA в течение 5 дней клетки N-типа приобретали нейроноподобные характеристики с большей готовностью, чем клетки S-типа. Однако на 10-й день после РА процент клеток S-типа в культуре увеличился, и культуры зарастали популяцией S-типа.Таким образом, краткосрочное лечение РА (до 5 дней), по-видимому, индуцировало дифференцировку клеток N-типа, но более длительное лечение (> 10 дней) способствовало пролиферации клеток S-типа, тем самым способствуя несбалансированному соотношению клеток S-типа к клеткам N-типа. Основываясь на таких результатах, при планировании экспериментов in vitro следует учитывать не только количество пассажей, но и фенотип клеток в культуре. Одно из возможных решений для предотвращения дисбаланса, рекомендованное Encinas et al. представляет собой добавление 50 нг / мл BDNF к обработанным RA культурам, поскольку, как сообщается, RA индуцирует рецепторы TrkB на SH-SY5Y клетках с максимальной экспрессией через 5 дней после воздействия BDNF.Удаление сыворотки в сочетании с обработкой BDNF рекомендуется для предотвращения репликации клеток S-типа. Включение сыворотки во время лечения RA-BDNF может способствовать пролиферации S-типа, которая наблюдается в виде монослоя S-клеток под дифференцирующимися клетками N-типа. Культуры, поддерживаемые в бессывороточных условиях с добавлением BDNF, были стабильными до 3 недель без чрезмерного роста клеток S-типа с минимальным апоптозом клеток, как определено с помощью анализа TUNEL и биохимических анализов. С помощью BDNF клетки задерживаются, но удаление BDNF побуждает клетки вступать в S-фазу клеточного цикла [2].

Популяции дифференцированных клеток состоят из двух морфологически различных типов: «S» и «N». Клетка типа «S» похожа на эпителий без отростков ( стрелки ), тогда как тип «N» более похож на нейроны с телами пирамидальной формы ( звездочка ) и длинными отростками ( стрелок )

Нейроны Маркерную экспрессию культур, подвергшихся воздействию RA, BDNF и бессывороточных условиях, оценивали с помощью иммуноцитохимии и вестерн-анализов. В этих исследованиях ни необработанные, ни обработанные RA-BDNF клетки SH-SHY5Y не экспрессировали GFAP, но NSE был обнаружен во всех условиях.С другой стороны, нейрофиламенты средней и высокой молекулярной массы были обнаружены в необработанных и обработанных 5-дневным RA нейронах, но исчезли после добавления BDNF. Экспрессия GAP-43 увеличивалась после 5 дней лечения RA с последующим 1 днем ​​лечения BDNF. Однако продолжение лечения BDNF в течение 3–9 дней привело к возвращению уровней GAP-43 к исходному уровню. Авт. Предполагают, что этот профиль экспрессии совпадает с высокими уровнями расширения нейритов, во время которых необходим GAP-43. Однако удаление RA из среды, содержащей BDNF, также могло внести свой вклад.

1.8 Маркеры рецепторов / транспортеров

1.8.1 Дофаминергические нейроны

SH-SY5Y Клетки как в недифференцированном, так и в дифференцированном состоянии экспрессируют ряд дофаминергических нейрональных маркеров. Эти клетки экспрессируют TH, фермент, критически важный для катализа дофамина и, далее, норадреналина (норадреналина) и адреналина (адреналина) [20]. Важно отметить, что клетки SH-SY5Y также экспрессируют переносчик дофамина (DAT), а также подтипы 2 и 3 дофаминовых рецепторов (D2R и D3R), что делает их образцовой системой in vitro для исследования нейротоксичности в дофаминергических нейронах, а также для лекарств, которые, как известно, оказывают первичное действие за счет активации дофаминовых рецепторов [31].Экспрессия TH, DAT, D2R и D3R, как было показано, увеличивается после дифференцировки в ряде исследований, особенно когда комбинация RA и TPA используется для индукции дифференцировки [7, 15, 32]. Однако существует также масса литературы, в которой не сообщается о значительной разнице в уровнях TH или DAT после дифференцировки, хотя в этих исследованиях обычно использовался только RA или агенты, которые способствуют недофаминергическому фенотипу для индукции дифференцировки [12, 33].

1.8.2 Адренергические нейроны

Клетки SH-SY5Y могут приводить к адренергическому фенотипу посредством RA- или TPA-индуцированной дифференцировки. Опять же, требуется экспрессия TH, поскольку нор-адреналин и адреналин являются производными дофамина, катализируемыми TH-зависимым образом [20]. Исследования показывают, что как дифференцированные, так и недифференцированные клетки SH-SY5Y с большим числом пассажей экспрессируют достаточные уровни дофамин-β-гидроксилазы, фермента, который катализирует образование нор-адреналина из дофамина, и способны превращать внутриклеточный дофамин в нор-адреналин. (нор-адреналин).Кроме того, клетки SH-SY5Y экспрессируют транспортер норадреналина (NET) и транспортер везикулярных моноаминов (VMAT), характерные для адренергических нейронов.

1.8.3 Холинергические нейроны

Об экспрессии мускариновых и никотиновых рецепторов ацетилхолина сообщалось в клетках SH-SY5Y . Мускариновые рецепторы, связанные с G-белком, присутствуют на мембранах как недифференцированных, так и дифференцированных клеток, хотя уровни и связывающие свойства по-разному регулируются в соответствии с методом дифференцировки.Например, лечение TPA уменьшается, тогда как лечение RA увеличивает количество сайтов связывания мускаринов [4]. Клетки, обработанные как TPA, так и RA, демонстрируют значительно повышенную активность ацетилхолинэстеразы по сравнению с недифференцированными клетками. Однако было показано, что только лечение РА увеличивает активность холинацетилтрансферазы [4]. Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы с управляемым лигандом ионным каналом (nAChR) также присутствуют в клетках SH-SY5Y и считаются аналогами nAChR ганглиозного типа человека [34, 35].Было показано, что nAChR на SH-SY5Y клетках десенсибилизирует в ответ на никотин, но восстанавливает полную чувствительность после вымывания, аналогично тому, что, как известно, происходит в первичных нейронах после активации рецептора [36].

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Профилирование поверхностных маркеров клеток SH-SY5Y позволяет проводить скрининг малых молекул, идентифицирующий BMP4 как модулятор дифференцировки нейробластомы

  • 1.

    Cheung, N.-K. В. и Дайер, М. А. Нейробластома: биология развития, геномика рака и иммунотерапия. Nat. Преподобный Рак 13 , 397–411 (2013).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 2.

    Марис, Дж. М. и др. . Нейробластома. Lancet (Лондон, Англия) 369 , 2106–20 (2007).

    CAS Статья Google ученый

  • 3.

    Боева В. и др. . Неоднородность идентичности клеток нейробластомы, определяемая схемами транскрипции. Нат . Генет . (2017). https://doi.org/10.1038/ng.3921

  • 4.

    van Groningen, T. et al. . Нейробластома состоит из двух состояний дифференцировки, связанных с суперэнхансерами. Nat. Genet. 49 , 1261–1266 (2017).

    Артикул PubMed Google ученый

  • 5.

    Обертюр, А., Тайссен, Дж., Вестерманн, Ф., Херо, Б. и Фишер, М. Молекулярная характеристика и классификация нейробластомы. Futur. Онкол. 5 , 625–639 (2009).

    CAS Статья Google ученый

  • 6.

    Бухагиар А. и Айерс Д. Химиорезистентность, раковые стволовые клетки и влияние миРНК: случай нейробластомы. Анал . Ячейка . Патол . (Амст) . 150634 https://doi.org/10.1155/2015/150634 (2015).

  • 7.

    Мюллер, С. и Маттей, К. К. Нейробластома: биология и стадия. Curr. Онкол. Репу . 11, 431–8 (2009).

  • 8.

    CDC. Статистика рака США. Статистика рака США: Интернет-отчет о заболеваемости и смертности. Атланта: Министерство здравоохранения и социальных служб США, Центры по контролю и профилактике заболеваний и Национальный институт рака.на https://nccd.cdc.gov/uscs/childhoodcancerdetailedbyICCC.aspx (2017).

  • 9.

    Хата, А. Н., Энгельман, Дж. А. и Фабер, А. С. Семейство BCL2: ключевые медиаторы апоптотического ответа на направленную противоопухолевую терапию. Рак Дисков . 5 , 475–87 (2015).

  • 10.

    Эрландсон, Р. А. и Несланд, Дж. М. Опухоли эндокринной / нейроэндокринной системы: обзор. Ultrastruct. Патол. 18 , 149–70 (1994).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 11.

    Кон, С. Л. и др. . Система классификации Международной группы риска нейробластомы (INRG): отчет рабочей группы INRG. J. Clin. Онкол. 27 , 289–297 (2009).

    Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

  • 12.

    Рейнольдс, К.П., Маттей, К. К., Виллабланка, Дж. Г. и Маурер, Б. Дж. Ретиноидная терапия нейробластомы высокого риска. Cancer Lett. 197 , 185–192 (2003).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 13.

    Mengelbier, L.H. et al. . Разнообразие внутриопухолевого генома параллельно прогрессированию и предсказывает исход при детском раке. Nat. Commun. 6 , 6125 (2015).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 14.

    Шрамм, А. и др. . Мутационная динамика между первичными и рецидивирующими нейробластомами. Nat. Genet. 47 , 872–877 (2015).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 15.

    Альтхофф К. и др. . Cre-conditional MYCN-управляемая модель нейробластомы мыши как улучшенный инструмент для доклинических исследований. Онкоген 34 , 3357–3368 (2015).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 16.

    Бельтингер К. и Дебатин К. М. Мышиные модели для экспериментальной терапии детских солидных опухолей с плохим прогнозом. Внутр. J. рак 92 , 313–8 (2001).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 17.

    Зейтц, Г., Армеану-Эбингер, С., Варманн, С. и Фукс, Дж. Животные модели экстракраниальных педиатрических солидных опухолей. Онкол. Lett. 4 , 859–864 (2012).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 18.

    Циглер М. М., Ишизу Х., Нагабучи Э., Такада Н. и Арья Г. Сравнительный обзор иммунобиологии нейробластомы мыши и нейробластомы человека. Рак 79 , 1757–1766 (1997).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 19.

    Анисимов В. Н., Украинцева С. В., Яшин А. И. Рак у грызунов: говорит ли он о раке у человека? Nat. Преподобный Рак 5 , 807–819 (2005).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 20.

    Щор Н.Ф. Нейробластома. Drug Discov.Сегодня Дис. Модель. 3 , 387–390 (2006).

    Артикул Google ученый

  • 21.

    Чиккарон, В., Шпенглер, Б. А., Мейерс, М. Б., Бидлер, Дж. Л. и Росс, Р. А. Фенотипическая диверсификация в клетках нейробластомы человека: экспрессия различных клонов нервного гребня. Cancer Res. 49 , 219–225 (1989).

    CAS PubMed Google ученый

  • 22.

    Росс, Р. А., Бидлер, Дж. Л. и Шпенглер, Б. А. Роль различных типов клеток в определении злокачественности в клеточных линиях и опухолях нейробластомы человека. in Письма о раке 197 , 35–39 (Elsevier, 2003).

  • 23.

    Накагавара А., Азар К. Г., Скаварда Н. Дж. И Бродер Г. М. Экспрессия и функция TRK-B и BDNF в нейробластомах человека. Мол. Клетка. Биол. 14, , 759–767 (1994).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 24.

    Гао, К. и др. . Повышенная экспрессия рецептора TrkA связана с дифференцировкой нейробластомы, полностью индуцированной транс-ретиноевой кислотой. Genet. Мол. Res. 14 , 13195–202 (2015).

    ADS CAS Статья PubMed Google ученый

  • 25.

    Combaret, V. et al. . Клиническая значимость экспрессии на поверхности клеток CD44 и амплификации гена N-myc в многоцентровом анализе 121 детской нейробластомы. J. Clin. Онкол. 14 , 25–34 (1996).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 26.

    Гиллиам Д. Т., Менон В., Бретц Н. П. и Прушак Дж. Поверхностный антиген CD24 в развитии нервной системы и заболевании. Neurobiol. Дис. 99 , 133–144 (2016).

    Артикул PubMed Google ученый

  • 27.

    Siapati, E. K., Rouka, E., Kyriakou, D. & Vassilopoulos, G. Клетки нейробластомы, отрицательные по CD44, обладают свойствами инициирования опухоли. Cell. Онкол. (Дордр). 34 , 189–97 (2011).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 28.

    Фликингер, К. С., Джудваре, Р., Лехнер, Р., Картер, В. Г. и Калп, Л. А. Экспрессия интегрина в клетках нейробластомы человека с или без амплификации N-myc и в эктопических / ортотопических опухолях голых мышей. Exp. Cell Res. 213 , 156–163 (1994).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 29.

    Schlitter, A.-M. и др. . Клетки нейробластомы CD57 (высокий уровень) имеют агрессивные признаки ex situ и недифференцированный фенотип у пациентов. PLoS Один 7 , e42025 (2012).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 30.

    Ferreira-Facio, C. S. et al. . Вклад иммунофенотипирования многопараметрической проточной цитометрии в диагностический скрининг и классификацию рака у детей. PLoS Один 8 , e55534 (2013).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 31.

    да Кунья, Дж. П. К. и др. . Биоинформатика построения поверхностного слоя клетки человека. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 106 , 16752–7 (2009).

    ADS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 32.

    Town, J. et al. . Изучение поверхностного слоя саркомы Юинга позволяет выявить новую уникальную терапевтическую цель. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 113 , 3603–8 (2016).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 33.

    Чаттопадхай, П. К. и Родерер, М. Цитометрия: современные технологии и перспективы будущего. Методы 57 , 251–8 (2012).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 34.

    Моррисон, Л. К. и др. . Деконструкция клеточной гетерогенности медуллобластомы выявляет различия между наиболее инвазивными и самообновляющимися фенотипами. Новообразование 15 , 384–98 (2013).

    Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

  • 35.

    Турас, Г. и др. . Комбинированный проточно-цитометрический анализ поверхностных и внутриклеточных антигенов выявляет поверхностные молекулярные маркеры нейропоэза человека. PLoS Один 8 , e68519 (2013).

    ADS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 36.

    Прушак Дж. Поверхностные нейронные антигены: от фундаментальной биологии к биомедицинским приложениям .(Elsevier, 2015).

  • 37.

    Сейс, Ю., Ван Гассен, С. и Ламбрехт, Б. Н. Вычислительная проточная цитометрия: помогает разобраться в многомерных данных иммунологии. Nat. Rev. Immunol. 16 , 449–62 (2016).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 38.

    Mair, F. et al. . Конец стробирования? Введение в автоматизированный анализ данных цитометрии большого размера. Eur. J. Immunol. 46 , 34–43 (2016).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 39.

    Qiu, P. et al. . Извлечение клеточной иерархии из данных цитометрии большого размера с помощью SPADE. Nat. Biotechnol. 29 , 886–91 (2011).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 40.

    Броннер-Фрейзер, М. Анализ ранних стадий миграции ствола нервного гребня у эмбрионов птиц с использованием моноклональных антител HNK-1. Dev. Биол. 115 , 44–55 (1986).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 41.

    Гуань, X. Метастазы рака: проблемы и возможности. Acta Pharm. Грех. B 5 , 402–18 (2015).

    Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

  • 42.

    Ян, Ю.-Г. и др. . Тетраспанины: от солидных опухолей до гематологических злокачественных новообразований. Exp. Гематол. 44 , 322–328 (2016).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 43.

    Чен Дж. и др. . Регуляция CD59 с помощью SOX2 необходима для стволовых клеток эпителиального рака, чтобы избежать надзора за комплементом. Отчеты о стволовых клетках 8 , 140–151 (2017).

    Артикул PubMed Google ученый

  • 44.

    Лю, X., Квон, Х., Ли, З. и Фу, Y.-X. Является ли CD47 контрольной точкой врожденного иммунитета для уклонения от опухоли? J. Hematol. Онкол. 10 , 12 (2017).

    Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

  • 45.

    Мишан, М. А., Ахмадианкия, Н. и Бахрами, А. Р. CXCR4 и CCR7: две подходящие цели в таргетной терапии рака. Cell Biol. Int. 40 , 955–967 (2016).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 46.

    Ринг, Э. К., Маркерт, Дж. М., Гиллеспи, Г. Ю. и Фридман, Г. К. Контрольные белки в головном мозге у детей и экстракраниальные солидные опухоли: возможности для иммунотерапии. Клин . Cancer Res . 23 (2017).

  • 47.

    Эскудеро, К. А. и др. . Проангиогенная роль инсулина: от физиологии к патологии. Фронт. Physiol. 8 , 204 (2017).

    Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

  • 48.

    Tortorella, S. & Karagiannis, T. C. Эндоцитоз, опосредованный рецепторами трансферрина: полезная мишень для терапии рака. J. Membr. Биол. 247 , 291–307 (2014).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 49.

    Мэгисон, М. Л., Гиллори, Л. А. и Байерле, Е. А. Передача сигналов выживания клеток в нейробластоме. Anticancer. Agents Med. Chem. 13 , 563–75 (2013).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 50.

    Бельмадани, А. и др. . Хемокиновый фактор-1, полученный из стромальных клеток, регулирует миграцию сенсорных клеток-предшественников нейронов. Дж . Neurosci . 25 ( 16 ) , (2005).

  • 51.

    Burger, J. A. & Kipps, T. J. CXCR4: ключевой рецептор в перекрестном соединении между опухолевыми клетками и их микроокружением. Кровь 107 , 1761–1767 (2006).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 52.

    Геминдер, Х. и др. . Возможная роль CXCR4 и его лиганда, фактора-1, производного от хемокинов стромы CXC, в развитии метастазов в костный мозг при нейробластоме. J Immunol Арт. 167 , 4747–4757 (2001).

    CAS Статья Google ученый

  • 53.

    Zhang, L., Yeger, H., Das, B., Irwin, M. S. & Baruchel, S. Тканевое микроокружение модулирует экспрессию CXCR4 и метастазирование опухоли в нейробластому. Новообразование 9 , 36–46 (2007).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 54.

    Aust, G., Zhu, D., Van Meir, E. G. & Xu, L. Adhesion GPCRs in Tumorigenesis. Handb. Exp. Pharmacol. 234 , 369–396 (2016).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 55.

    Xiong, L., Edwards, C. K., Zhou, L. & Zhou, L. Биологическая функция и клиническое использование CD147 при заболеваниях человека: обзор современной научной литературы. Внутр. J. Mol. Sci. 15 , 17411–41 (2014).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 56.

    Rawnaq, T. и др. . L1 сильно экспрессируется в опухолях нервной системы: исследование более 8000 тканей человека. J. Surg. Res. 173 , 314–319 (2012).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 57.

    Валентинер У., Валентинер Ф.-У. & Schumacher, U. Экспрессия CD44 связана с метастатическим паттерном клеток нейробластомы человека в модели ксенотрансплантата мыши SCID. Tumor Biol. 29 , 152–60 (2008).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 58.

    Мина-Осорио, П. Подрабатывающий фермент CD13: старые и новые функции для нацеливания. Trends Mol. Med. 14 , 361–371 (2008).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 59.

    Джей Д. Л., Брей Р. А., Гебель Х. М., Харрис В. А. и Уоллер Е. К. Трансляционные приложения проточной цитометрии в клинической практике. J. Immunol. 188 , 4715–9 (2012).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 60.

    Хиндли, К. Дж. и др. . Участник пути Hippo YAP усиливает судьбу и миграцию клеток нервного гребня человека. Sci. Rep. 6 , 23208 (2016).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 61.

    Яп, Т. А., Герлингер, М., Футреал, П. А., Пуштаи, Л. и Свантон, К. Внутриопухолевая неоднородность: видя лес за деревьями. Sci . Перевод . Мед . 4 (2012).

  • 62.

    Уорд Р. Дж. и др. .Мультипотентные раковые стволовые клетки CD15 + в медуллобластоме мыши с дефицитом патч-1. Рак Res 69 , 4682–90 (2009).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 63.

    Prasad, M. S., Sauka-Spengler, T. и LaBonne, C. Индукция состояния нервного гребня: контроль атрибутов стволовых клеток посредством регуляторных, посттранскрипционных и эпигенетических взаимодействий генов. Dev.Биол. 366 , 10–21 (2012).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 64.

    Müller, P. et al. . Аддитивные эффекты ретиноевой кислоты (RA) и костного морфогенетического белка 4 (BMP-4) на передачу сигналов апоптоза в клеточных линиях ретинобластомы. PLoS Один 10 , e0131467 (2015).

    Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

  • 65.

    Амброс, П. Ф. и др. . Международный консенсус в отношении молекулярной диагностики нейробластомы: отчет Комитета по биологии Международной группы риска нейробластомы (INRG). Br. J. Рак 100 , 1471–82 (2009).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 66.

    Джоши, С., Гулерия, Р., Пан, Дж., Дипетт, Д. и Синг, США, рецепторы ретиноевой кислоты и тканевая трансглутаминаза опосредуют кратковременный эффект ретиноевой кислоты на миграцию и инвазию нейробластомы. Клетки SH-SY5Y. Онкоген 25 , 240 (2005).

    Google ученый

  • 67.

    Глозак М. А. и Роджерс М. Б. Апоптоз, индуцированный ретиноевой кислотой и костным морфогенетическим белком 4, в клетках эмбриональной карциномы P19 Требуется p27. Exp. Cell Res. 268 , 128–138 (2001).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 68.

    Де лос Сантос, М., Замбрано, А. и Аранда, А. Комбинированное действие ингибиторов ретиноевой кислоты и гистондеацетилазы на клетки нейробластомы человека SH-SY5Y. Мол . Cancer Ther . 6 (2007).

  • 69.

    Хан, К. К. и др. . Скрининг на основе экспрессии определяет комбинацию ингибиторов гистондеацетилазы и ретиноидов для дифференцировки нейробластомы. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 105 , 9751–6 (2008).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 70.

    Rettig, I. et al. . Селективное ингибирование HDAC8 снижает рост нейробластомы in vitro и in vivo и усиливает дифференцировку, опосредованную ретиноевой кислотой. Cell Death Dis. 6 , e1657 (2015).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 71.

    Hämmerle, B. и др. . Нацеливание на стволовые клетки нейробластомы с помощью ретиноевой кислоты и ингибитора протеасомы. PLoS Один 8 , e76761 (2013).

    ADS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 72.

    Biedler, J. L., Helson, L. & Spengler, B. A. Морфология и рост, опухолеобразование и цитогенетика клеток нейробластомы человека в непрерывной культуре Морфология и рост, опухолеобразование и цитогенетика клеток нейробластомы человека1. Cancer Res. 33 , 2643–2652 (1973).

    CAS PubMed Google ученый

  • 73.

    Менон В., Томас Р., Гейл А. Р., Рейнхард К. и Прушак Дж. Протоколы проточной цитометрии для анализа поверхностных и внутриклеточных антигенов типов нервных клеток. Дж . Vis . Опыт . e52241 – e52241 https://doi.org/10.3791/52241 (2014 г.).

  • 74.

    Падж, М., Норрис, М. Д., Кон, С. Л. и Хабер, М. Роль гена белка 1, связанного с множественной лекарственной устойчивостью, в биологии нейробластомы и клинических исходах. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2005.01.060.

  • 75.

    Джордано Г. и др. . Связанная с раком избыточная экспрессия CD15 / FUT4 снижает эффективность агентов, нацеленных на EGFR или VEGF, действующих как новый нижележащий регулятор киназы RAF-MEK-ERK при метастатическом колоректальном раке. J. Exp. Clin. Cancer Res. 34 , 108 (2015).

    Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

  • 76.

    Гарридо, Ф. и др. . Избегание рака от Т-клеточного иммунного надзора: потеря HLA класса I и архитектура опухолевых тканей. Вакцины 5 (2017).

  • 77.

    Кантор, Дж. М. и Гинзберг, М. Х. CD98 на перекрестке адаптивного иммунитета и рака. J. Cell Sci. 125 , 1373–82 (2012).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 78.

    Ата Р. и Антонеску К. Н. Интегрины и клеточный метаболизм: интимные отношения, влияющие на рак. Инт . Дж . Мол . Sci . 18 (2017).

  • 79.

    Накагавара А., Арима М., Азар К. Г., Скаварда Н.J. & Brodeur, G.M. Обратная связь между экспрессией trk и амплификацией N-myc в нейробластомах человека. Cancer Res . 52 (1992).

  • 80.

    Nakagawara, A. et al. . Связь между высоким уровнем экспрессии гена TRK и благоприятным исходом при нейробластоме человека. N. Engl. J. Med. 328 , 847–854 (1993).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 81.

    Bothwell, M. и др. . Отслеживание рецепторов нейротрофина. Ячейка 65 , 915–8 (1991).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 82.

    Brodeur, G. M. & Bagatell, R. Механизмы регрессии нейробластомы. Nat. Преподобный Clin. Онкол. 11 , 704–13 (2014).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • SH-SY5Y: Клеточная линия нейробластомы человека (ATCC CRL-2266)

    Описание

    SH-SY5Y представляет собой трижды субклонированную линию клеток, полученную из линии клеток нейробластомы SK-N-SH.Он служит моделью нейродегенеративных расстройств, поскольку клетки могут быть преобразованы в различные типы функциональных нейронов путем добавления определенных соединений. Кроме того, линия клеток SH-SY5Y широко использовалась в экспериментальных неврологических исследованиях, включая анализ нейрональной дифференцировки, метаболизма и функций, связанных с нейродегенеративными процессами, нейротоксичностью и нейрозащитой.

    Источник

    Эта линия клеток была получена из субклона SH-SY родительской линии клеток нейробластомы человека SK-N-SH.Родительская линия клеток SK-N-SH была создана в 1970 году из метастатических клеток, обнаруженных в аспирате костного мозга четырехлетней женщины неизвестной этнической принадлежности.

    Изобретателей

    • Джун Л. Бидлер, доктор философии, бывший председатель программы клеточной биологии и генетики, Институт Слоана Кеттеринга, Мемориал Слоана Кеттеринга
    • Барбара А.Шпенглер, ранее работавший в Институте Слоана Кеттеринга, Мемориал Слоуна Кеттеринга

    Основные ссылки

    Росс Р.А. и др. (1983) Координированное морфологическое и биохимическое взаимопревращение клеток нейробластомы человека. Журнал Национального института рака 71: 741-748 (PubMed ID: 6137586 )

    Информация о лицензировании

    Эта линия клеток может быть лицензирована не исключительно для исследовательских или коммерческих целей.

    Для внутренних исследований коммерческой организацией : Используйте MSK Express License , прилагаемую сюда.Условия этой неисключительной лицензии не подлежат обсуждению в целях упрощения и ускорения лицензирования отдельных линий клеток MSK. Обратите внимание: эта лицензия доступна только для выбранных линий клеток, включая эту.

    Чтобы продолжить, загрузите этот контракт, заполните все соответствующие поля и отправьте отсканированную версию по адресу [email protected] Как только эта лицензия будет оформлена MSK, вы получите подписанную копию и счет, а затем сможете разместить заказ в ATCC.

    По вопросам лицензирования для коммерческих целей : обратитесь в отдел материальных материалов MSK по адресу TRMOTDRTM @ mskcc.орг.

    Для запросов, не связанных с лицензированием, от научно-исследовательских институтов : свяжитесь с Фрэнсис Вайс-Гарсия, доктором философии, ассоциированным членом лаборатории / руководителем основного центра по изучению антител и биоресурсов, MSK, 646-888-2354, [email protected]

    Свойства дифференцированного SH-SY5Y, выращенного на углеродных материалах

    Дифференцировка нервных клеток широко изучалась в двумерных (2D) планшетах для культивирования клеток. Однако клеточное микросредство и внеклеточный матрикс (ВКМ) намного сложнее, и плоские 2D-поверхности трудно имитировать в ВКМ.Углеродные нанотрубки (УНТ) и графены представляют собой многомерные наноматериалы на основе углерода и могут обеспечивать дополнительные измерения для роста и дифференциации клеток. Чтобы определить влияние УНТ и поверхностей графена на рост, экспрессию генов, дифференциацию и функциональность нейробластомы в нервной клетке, клетки SH-SY5Y выращивали на 2D (контрольной) поверхности, сетке УНТ и пленке графена. Данные показывают, что клетки SH-SY5Y, выращенные на поверхности УНТ, показывают в среднем 20,2% повышение жизнеспособности клеток; 5.Снижение на 7% количества клеток, подвергающихся апоптозу; 78,3, 43,4 и 38,1% увеличение экспрессии SOX2, GFAP и NeuN соответственно; и увеличение средней скорости стрельбы на многоэлектродной решетке на 29,7%. Клетки SH-SY5Y, выращенные на графеновой пленке, демонстрируют незначительные изменения свойств клеток или их отсутствие по сравнению с клетками, выращенными в 2D. Данные показывают, что трехмерная (3D) поверхность УНТ обеспечивает благоприятную среду для клеток SH-SY5Y для пролиферации и дифференцировки в нейроны.

    Эта статья в открытом доступе

    Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуйте снова? .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *