Сошникова елена: МОСКОВСКИЙ ТЕАТР ОПЕРЕТТЫ – официальный сайт :: СОШНИКОВА (СЕЛИВЕРСТОВА) Елена Эдуардовна

0 Разное

Содержание

Сошникова Елена Викторовна, ИНН 182806521983

Общие сведения:

ФИО: СОШНИКОВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА

ИНН: 182806521983

Состоит в реестре субъектов малого и среднего предпринимательства с 01.08.2016 по Республика Удмуртская,Город Воткинск с ОКВЭД 47.72

Регистрации в качестве Индивидуального предпринимателя (ИП):

ОГРН: 304182812800199
Статус: Действующее
Дата регистрации: 07 мая 2004 года
Место регистрации: МЕЖРАЙОННАЯ ИНСПЕКЦИЯ ФЕДЕРАЛЬНОЙ НАЛОГОВОЙ СЛУЖБЫ № 3 ПО УДМУРТСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ
ОКВЭД: 47.72 – Торговля розничная обувью и изделиями из кожи в специализированных магазинах
Дополнительные виды деятельности по ОКВЭД:

д. Эта группировка не включает: - розничную торговлю текстильными товарами, см. 47.51″>
47.52.6Торговля розничная садово-огородной техникой и инвентарем в специализированных магазинах
47.71Торговля розничная одеждой в специализированных магазинах
47.82Торговля розничная в нестационарных торговых объектах и на рынках текстилем, одеждой и обувью
47. 91Торговля розничная по почте или по информационно-коммуникационной сети Интернет
68.20Аренда и управление собственным или арендованным недвижимым имуществом

Госзакупки по 44-ФЗ: нет

Госзакупки по 223-ФЗ: нет

Арбитраж (1 шт.):

НомерДатаСторонаОписание
А71-9787/201526. 08.2015Ответчико привлеч. к админ. ответ-ти за нарушен. треб. проект. докум-ции, порядка строит-ва, невып. в срок закон. предписания органов по надзору в области строительства (ст. 9.4, 9.5, 9.5.1, ч.6 ст.19.5 КоАП РФ)

Руководитель организаций:

Учредитель компаний:

ТСЖ-1
ТОВАРИЩЕСТВО СОБСТВЕННИКОВ ЖИЛЬЯ
доля:
телефон: +7 (34145) 3-25-13
инн: 1828012381 огрн: 1041800080850
адрес: УДМУРТСКАЯ РЕСПУБЛИКА,Г ВОТКИНСК,УЛ ПРОЛЕТАРСКАЯ,31-Г
Вид деятельности: Аренда и управление собственным или арендованным жилым недвижимым имуществом

Скачать данный список организаций в Excel формате

Сошникова Елена Александровна

Врач-терапевт второй категории

Врач-терапевт второй категории.

Уважаемые пациенты !

Обращаем Ваше внимание на то, что в соответствии с п.

10.ст.16 Федерального Закона “Об обязательном медицинском страховании” №326-ФЗ от 29.11.2010 года, при каждом обращении за медицинской помощью в ОКДЦ, вы должны предъявить свой полис ОМС в регистратуре центра.

Подробнее

Уважаемые пациенты!

В приемном отделении ОКДЦ с 8.00 до 15.00 работает процедурный кабинет, где по назначению врача, на платной основе выполняются инъекции, включая:
-внутривенно-капельную инфузию,
-внутривенно-струйную инъекцию,
-внутримышечную инъекцию,
– подкожную инъекцию,
-премедикацию (обезболивание) перед проведением исследований МРТ.

СКТ, коронарографии, ФГДС, ФКС и бронхоскопии.

Если Вы хотите получить эту медицинскую услугу, Вам необходимо обратиться в регистратуру ОКДЦ, имея при себе заключение Вашего лечащего врача и его рекомендации.

Подробнее

Уважаемые пациенты!

Запись на повторный прием проводится только через телефон Вашего лечащего врача ОКДЦ, информация об этом имеется в маршрутном листе.

На первичный прием Вы можете записаться самостоятельно через сайт или единый телефон Call-центра 8(863) 227-00-00

Подробнее

Уважаемые пациенты!

С целью предупреждения распространения вирусных инфекций, таких как грипп, ОРВИ, новый коронавирус 2019-nCoV, а так же ввиду отсутствия в ГАУ РО «ОКДЦ» врача-инфекциониста, пациентам с температурой, насморком, чиханием, кашлем, головной болью, болью в горле, рекомендовано обращаться к врачу-инфекционисту либо врачу-терапевту в медицинскую организацию по месту жительства.

Подробнее

«КРТ определит развитие отрасли не только в сфере жилищного строительства»

Группа компаний АВА — девелопер федерального уровня полного цикла. Более 90% проектов предприятия строится в рамках комплексного развития территорий в Краснодаре, Сочи, Анапе, Москве. О видах комплексного развития территорий и практике их применения рассказала советник президента по развитию холдинга AVA Group Елена Сошникова.

В декабре 2020 года подписан федеральный закон, который существенно изменил Градостроительный и Жилищный кодексы, установив применение единого механизма комплексного развития территорий для нежилых и незастроенных территорий и для жилых территорий, требующих обновления в связи с их аварийностью и высокой изношенностью расположенных в границах данных территорий жилых и иных объектов и обеспечивающей их инфраструктуры. 

Зачем понадобились изменения?  «Прежде всего это связано с необходимостью изменения градостроительных подходов и комплекса нормативно-правового регулирования, применяемых при планировании развития территории, — поясняет Елена Сошникова.

— Необходимо было изменить подход к созданию городской среды, которая будет отвечать новым социально-экономическим условиям. 

Несмотря на то, что многие застройщики уже не первый год говорят о том, что реализация проектов ведется в соответствии с комплексным развитием территорий, как таковая правовая основа, которая определит развитие строительной отрасли, формируется и стандартизируется в настоящий момент».

Новый закон структурировал и определил четыре вида комплексного развития территорий. 

Первое — это комплексное развитие территорий жилой застройки, когда в проект включаются территории, где расположены аварийные здания, с высоким физическим износом, в ограниченно работоспособном техническом состоянии или с отсутствующими централизованными инженерными коммуникациями. Второе — когда на территории расположены объекты нежилого назначения, в том числе аварийные или самовольные постройки, а также виды разрешенного использования земельных участков и объектов, не соответствующих правилам землепользования и застройки.

 

Третий вид — КРТ незастроенной территории, когда на осваиваемой территории расположены земельные участки, находящиеся в муниципальной или госсобственности, не обремененные правами третьих лиц. 

И еще один вид комплексного развития территорий ведется по инициативе правообладателей земельных участков. 

Минстроем РФ совместно с ДОМ.РФ был предложен стандарт, который может лечь в основу формирования нормативно-правовой базы по данному вопросу.  Ключевые элементы городской среды, которые затрагивает этот стандарт, — это квартиры, жилые дома, придомовая территория, парковочные места, школы, плотность уличной сети, общественные пространства. 

Введение единого стандарта позволит определить основные принципы в подготовке проекта КРТ девелоперами, при этом не исключено, что на региональном уровне будут приняты свои принципы. 

«Мы сегодня в 90% случаев ведем строительство, основываясь на принципах комплексного развития территории, — подчеркивает Елена Сошникова. — Одним из таких примеров является ЖК «Кислород» в городе Сочи, где вместе с жилыми домами строятся образовательные объекты, детская поликлиника, экологический парк, призванный нести и образовательную функцию, и стать местом притяжения для жителей северного склона горы Бытха. 

Именно здесь впервые в регионе будет применено соучастное проектирование, когда проект будущего парка разрабатывается исходя от потребностей жителей». 

Операционный блок | ГУЗ Городская клиническая больница №1

Токарева Татьяна Артуровнастаршая медицинская сестра (акушер, фельдшер, операционная медицинская сестра, зубной техник), Операционный блоксреднее профессиональное, ГОУ СПО «ЧМК», 2011Сестринское дело,
Ануфриенко Виктория Евгеньевнаоперационная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональное, Ейское МУ, Сестринское дело, 1994Сестринское дело,
Воробьева Нина Владимировнаоперационная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональное, ЧМК, 2000Сестринское дело,
Горлачева Наталья Александровнаоперационная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональное, ГОУ СПО «ЧМК», Сестринское дело, 2013Сестринское дело,
Дементьева Елена Александровнаоперационная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональное, ГОУ СПО «ЧМК», Сестринское дело, 2002Сестринское дело,
Заболотская Любовь Николаевнаоперационная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональноеСестринское дело,
Засухина Наталья Викторовнаоперационная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональное, ГОУ СПО «ЧМК», Сестринское дело, 2012Сестринское дело,
Козлова Екатерина Сергеевнаоперационная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональное, ГОУ СПО «ЧМК», Сестринское дело, 2015Сестринское дело,
Козырева Нина Корниловнаоперационная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональное, ЧМУ, Сестринское дело, 1976Сестринское дело,
Корякина Елена Александровна (операционная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональное, ГОУ СПО «ЧМК», Сестринское дело, 2011Сестринское дело,
Матвеева Наталья Сергеевнаоперационная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональное, ГОУ СПО «ЧМК», Сестринское дело, 2001Сестринское дело,
Молчанова Татьяна Валерьевнаоперационная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональное, ЧМУ, Сестринское дело, 1992Сестринское дело,
Панова Елена Владимировнаоперационная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональное, ГОУ СПО «ЧМК», Сестринское дело, 2007Сестринское дело,
Рабданова Хавндама Цырендоржиевнаоперационная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональное, ЧМК, Сестринское дело, 1996операционное дело,
Сошникова Елена Борисовнаоперационная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональное, ЧМУ, Сестринское дело, 1991Сестринское дело,
Тугалева Ирина Ивановнаоперационная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональное, ЧМУ, Сестринское дело, 1979Сестринское дело,
Ушакова Наталья Ефимовнаоперационная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональное, ЧМУ, Сестринское дело, 1981Сестринское дело,
Черемных Елена Александровнаоперационная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональное, ЧМК, Сестринское дело, 1998Сестринское дело,
Шинкоренко Татьяна Владимировнаоперационная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональное, ГОУ СПО «ЧМК», Сестринское дело, 2009Сестринское дело,
Шишмарева Юлия Александровнаоперационная медицинская сестра, Операционный блоксреднее профессиональное, ГПОУ «ЧМК», Сестринское дело, 2017Сестринское дело,

История регистрации VIBRANT LIFE GLOBAL LTD – Поиск и обновление информации о компании

Результаты компании (ссылки открываются в новом окне)
Дата (документ был подан в Регистрационную палату) Тип Описание (документа, поданного в Регистрационную палату) Посмотреть / Скачать (PDF-файл, ссылка откроется в новом окне)
11 сен 2021 DISS16 (SOAS) Принудительная забастовка приостановлена ​​
10 августа 2021 г. ГАЗ1 First Gazette Уведомление о принудительном прекращении участия
18 янв 2021 CS01 Подтверждающее заявление от 25 сентября 2020 г. без обновлений
01 декабря 2020 CS01 Подтверждающее заявление от 25 сентября 2019 г. без обновлений
01 декабря 2020 DISS40 Действие принудительного исключения прекращено
30 ноя 2020 AA Счета микрокомпаний до 31 августа 2019 г.
30 ноя 2020 AA Счета микрокомпаний до 31 августа 2018 г.
07 сен 2019 DISS16 (SOAS) Принудительная забастовка приостановлена ​​
30 июл 2019 ГАЗ1 First Gazette Уведомление о принудительном прекращении участия
31 октября 2018 г. AAMD Скорректированная общая сумма освобожденных от уплаты налогов полных счетов до 31 августа 2017 г.
25 сен 2018 CS01 Подтверждающее заявление от 25 сентября 2018 г. без обновлений
18 июн 2018 AA Счета микрокомпаний до 31 августа 2017 г.
11 апреля 2018 AD01 Зарегистрированный адрес офиса изменился с с 60 Cannon Street London EC4N 6NP United Kingdom на 8-12 New Bridge Street London EC4V 6AL 11 апреля 2018 г.
25 октября 2017 г. AD01 Зарегистрированный адрес офиса изменен с с Suite 1, 5 Percy Street, Fitzrovia, London, W1T 1DG United Kingdom на 60 Cannon Street London EC4N 6NP 25 октября 2017 г.
26 сен 2017 AP01 Назначение г-на Чарльза Андриамаро директором 20 сентября 2017 г.
25 сен 2017 CS01 Подтверждающее заявление от 25 сентября 2017 г. с обновлениями
25 сен 2017 TM01 Прекращение назначения Дженнифер Кэтрин Рене директором 20 сентября 2017 г.
24 августа 2017 CS01 Подтверждающее заявление от 17 августа 2017 г. без обновлений
24 августа 2017 PSC01 Уведомление Елены Сошниковой как лица со значительным контролем 21 ноября 2016 г.
24 августа 2017 PSC09 Выход лица со значительным контрольным отчетом 24 августа 2017 г.
18 августа 2016 NEWINC Регистрация
Отчет о капитале на 18. 08.2016
  • МОДЕЛЬНЫЕ СТАТЬИ – Модельные изделия принятые

Последовательное фосфорилирование субъединицы PHF10 комплекса ремоделирования хроматина PBAF определяет различные свойства изоформ PHF10 | Биология Открыть

Фосфорилирование – наиболее распространенная и наиболее изученная посттрансляционная модификация у эукариот.Фосфорилирование участвует в регуляции различных клеточных процессов, таких как транскрипция и каталитическая активность; он может изменять структуру, конформацию, стабильность, локализацию и белковые взаимодействия белка (Nishi et al., 2014; Ubersax and Ferrell, 2007). Фосфорилирование допускает дополнительный уровень сложности и регулирования. Как отдельные белки, так и белки внутри комплексов могут фосфорилироваться, что, в свою очередь, может влиять на функцию всего комплекса.

Сайты фосфорилирования многих белков имеют тенденцию образовывать кластеры со многими близко расположенными аминокислотами, фосфорилированными одной и той же киназой.Важно отметить, что события фосфорилирования в кластерах имеют тенденцию координироваться с фосфорилированием каждой аминокислоты, определяемым фосфорилированием предыдущей (Freschi et al., 2014; Li et al., 2009, 2017; Schweiger and Linial, 2010).

Фосфорилирование, вероятно, важно для регуляции подсемейства PBAF млекопитающих комплекса SWI / SNF, ремоделирующего хроматин, который играет важную роль в регуляции транскрипции (Simone, 2006; Brechalov et al., 2016). Комплекс PBAF состоит из основных субъединиц, включая АТФазу (Brg1 или Brm) и сигнатурных субъединиц (BAF180, BRD7 и BAF200 и PHF10 / BAF45A), которые альтернативно включены в комплекс и необходимы для комплексного взаимодействия с хроматином (Moshkin et al. , 2007). Некоторые из основных белков PBAF, включая BAF155, BAF170, BAF47 и BAF60c, фосфорилируются. BAF155, BAF170 и BAF47 взаимодействуют с киназой Akt и фосфорилируются ею, и эти модификации регулируют гены сигнального пути Akt / PI3K и репликацию клеток (Foster et al., 2009).

Среди сигнатурных субъединиц PBAF только PHF10, как было показано, сильно фосфорилирован (Tatarskiy et al., 2017). PHF10 является очень важной субъединицей PBAF (Brechalov et al., 2014; Lessard et al., 2007), которая важна для взаимодействия PBAF с генами-мишенями. PHF10 представлен в клетках млекопитающих четырьмя изоформами, которые различаются своими N- и C-концевыми доменами (Brechalov et al., 2014), альтернативно включены в PBAF и имеют разные генные мишени.Включение различных изоформ PHF10 в PBAF изменяет функции всего комплекса и, таким образом, важно для изменения активности PBAF (Brechalov et al., 2016).

В предыдущей работе мы показали, что каждая изоформа PHF10 имеет свой уникальный паттерн фосфорилирования, который зависит от ее доменной структуры (Татарский и др. , 2017). Важная роль фосфорилирования заключается в поддержании разного уровня стабильности изоформ PHF10 в клетке, что, в свою очередь, влияет на их присутствие в комплексе.Мы продемонстрировали, что изоформы PHF10, в которых отсутствуют С-концевые домены PHD (PHF10-S), намного более стабильны в клетке, чем изоформы, содержащие PHD (Бречалов и др., 2016; Татарский и др., 2017). Серины 297, 301, 327 и 331 линкерного домена изоформ PHF10-S (обозначенные как X-кластер) перекрываются с β-TrCP дегронами и фосфорилируются казеинкиназой 1 (CK1), что предотвращает взаимодействие с b-TrCP. -убиквитин-лигаза и последующая деградация (Татарский и др., 2017).

В настоящем исследовании мы расширили наше понимание структуры и функции X-кластера и его роли в поддержании стабильности изоформ PHF10-S.Мы демонстрируем, что события фосфорилирования в X-кластере сильно скоординированы. X-кластер состоит из двух независимо фосфорилированных субкластеров, которые окружают потенциальный сигнал ядерной локализации (NLS3). Первый субкластер содержит два первичных фосфорилированных серина 297 и 301. Второй субкластер включает первичный фосфорилированный серин 327, его фосфорилирование запускает фосфорилирование серинов 331, а также серинов 323 и 335, которые также были фосфорилированы.Потенциальный сигнал NLS не нацелен на изоформы PHF10-S в ядро, но необходим для фосфорилирования окружающих аминокислот. Эти данные показывают сложный механизм регуляции стабильности PHF10 посредством сильно модифицированных новых доменов.

Доменная структура PHF10 представлена ​​на (рис. 1). Изоформы различаются доменной структурой их N- и C-концов, которая определяет возможные модификации фосфорилирования.Отсутствие C-концевых доменов PHD в двух изоформах (PHF10-Sl и PHF10-Ss) позволяет фосфорилировать их линкерный домен казеинкиназой 1 (CK1) (фосфорилирование X-кластера), что невозможно в изоформах, содержащих домены PHD. на C-конце (Татарский и др., 2017). Один из трех предсказанных сигналов ядерной локализации (NLS3) локализован в X-кластере (Рис. 1).

Рис. 1.

Организация домена и локализация X-кластера и сайтов ядерной локализации (NLS) в изоформах PHF10. Указаны N-концевой домен, SAY-домен, линкерный домен и двойные домены PHD или PDSM. NLS-2 и NLS-3 являются общими для всех изоформ PHF10, NLS-4 специфичен для изоформ PHF10-P. Серины X-кластера фосфорилируются в изоформах PHF10-S.

Рис. 1.

Организация домена и локализация X-кластера и сайтов ядерной локализации (NLS) в изоформах PHF10. Указаны N-концевой домен, SAY-домен, линкерный домен и двойные домены PHD или PDSM.NLS-2 и NLS-3 являются общими для всех изоформ PHF10, NLS-4 специфичен для изоформ PHF10-P. Серины X-кластера фосфорилируются в изоформах PHF10-S.

Ранее мы исследовали фосфорилирование X-кластера и показали (Татарский и др. , 2017), что CK1 фосфорилирует четыре аминокислотных остатка серина 297, 301, 327 и 331 (рис. 2A). Более того, серины 297, 301 и 327 фосфорилируются чаще, чем серин 331 (Татарский и др., 2017). Чтобы дополнить эти данные, мы проанализировали фосфо-модификации этого кластера, опубликованные в высокопроизводительных масс-спектрометрических скринингах, доступных через базу данных PhosphoSite (Hornbeck et al., 2015). Эта база данных позволяет сравнивать количество высокопроизводительных скринингов (HTS) фосфомодификаций, в которых данный остаток в белке был модифицирован. Наш анализ PhosphoSite показал, что X-кластер может также включать серины 323 и 335 (Fig. 2A). Эти сериновые остатки были обнаружены только в двух скринингах по сравнению с остатками 297, 301 и 327, которые были обнаружены в более чем 25 скринингах.Фосфорилирование серинов 319 и 339 не обнаружено; однако, исходя из аминокислотного мотива X-кластера, они также могут быть мишенями для фосфорилирования.

Рис. 2.

Серины 297/301 и 327 фосфорилируются независимо друг от друга и организованы в два независимых подкластера. (A) Неполная последовательность линкерного домена. Серины X-кластера выделены, а NLS-3 отмечен серым прямоугольником.Замена серинов на аланины в мутантах X-кластера и лизинов на аланины в NLS-мутантах обозначена светло-серыми прямоугольниками. (B) Меченый FLAG линкерный домен PHF10 и его мутированные формы X-кластера были сверхэкспрессированы в HEK293, а затем подвергнуты иммуноблоттингу с антителами против FLAG (верхняя панель). Нижняя панель представляет те же формы линкерного домена, сверхэкспрессированного в HEK293 и обработанного λ-PP перед загрузкой в ​​PAGE. Наложена горизонтальная белая линия, чтобы упростить сравнение подвижности диапазона.

Рис. 2.

Серины 297/301 и 327 фосфорилируются независимо друг от друга и организованы в два независимых подкластера. (A) Неполная последовательность линкерного домена. Серины X-кластера выделены, а NLS-3 отмечен серым прямоугольником. Замена серинов на аланины в мутантах X-кластера и лизинов на аланины в NLS-мутантах обозначена светло-серыми прямоугольниками. (B) Меченый FLAG линкерный домен PHF10 и его мутированные формы X-кластера были сверхэкспрессированы в HEK293, а затем подвергнуты иммуноблоттингу с антителами против FLAG (верхняя панель).Нижняя панель представляет те же формы линкерного домена, сверхэкспрессированного в HEK293 и обработанного λ-PP перед загрузкой в ​​PAGE. Наложена горизонтальная белая линия, чтобы упростить сравнение подвижности диапазона.

Последовательность линкерного домена PHF10 является консервативной, и при скрининге последовательностей мыши и крысы соответствующие аминокислотные остатки также фосфорилируются, что указывает на их важность (рис.2А). Мы предположили, что остатки серина 297, 301 и 327, которые часто обнаруживаются как фосфорилированные, могут влиять на фосфорилирование соседних серинов 32, 331 и 335 (Fig. 2A).

Фосфорилирование серинов впервые было исследовано в клетках HEK293. Мы экспрессировали рекомбинантные немутантные и мутированные формы линкерного домена, меченного FLAG, в клетках HEK293. В мутированных формах серины, которые были потенциальными мишенями фосфорилирования, были заменены аланином (рис.2А). Дикий тип и мутантные формы линкерного домена имели разную подвижность в геле PAAG (рис. 2B, верхняя панель). Обработка λ-PP полностью устраняет разницу в подвижности дикого типа и мутантных форм линкерного домена (рис. 2B, нижняя панель), указывая на то, что различная подвижность отражает разные уровни их фосфорилирования.

Линкерный домен дикого типа мигрирует в виде двух полос в геле PAAG (рис.2Б, переулок 1). Мутации сериновых остатков 297, 301 и 327 (рис. 2B, дорожки 6 и 7) сильно увеличили подвижность линкерного домена, который теперь мигрировал в виде единой полосы, подтверждая, что эти сериновые остатки были фосфорилированы, как было показано ранее (Татарский и др. др., 2017). Влияние мутаций в остатках 323 и 335 на подвижность в геле PAAG было намного ниже (рис. 2B, дорожки 3 и 5). Тем не менее, небольшое изменение фосфорилирования белков с мутированными серинами 323 и 335 наблюдалось, поскольку верхняя полоса, соответствующая полностью фосфорилированной форме линкерного домена, отсутствовала у мутанта по серину 323 и стала слабее у мутанта по серину 335. .Эти данные показывают, что серины 323 и 335 также фосфорилировались in vivo . Однако уровень их фосфорилирования был намного ниже, чем у серинов 297, 301 и 327.

Затем, чтобы изучить фосфорилирование исследуемых серинов, мы провели киназный анализ. Линкерный домен PHF10, а также его мутантные варианты экспрессировали в бактериях, очищали с использованием колонок с His-tag и инкубировали с лизатами HEK293 в присутствии [P] -ATP (фиг.3А). Мы обнаружили значительное снижение сигнала при мутации 297 и 301 остатков серина. Сигнал также частично снизился, когда 327 серин был мутирован, в то время как мутации в 323 и 335 сериновых остатках показали только небольшое снижение, что коррелирует с предполагаемым низким уровнем фосфорилирования (фиг. 3A; сравните дорожки 3 и 5 с линией 1). Таким образом, в этой системе in vitro мы подтвердили, что помимо часто фосфорилированных серинов 297, 301 и 327, X-кластер содержит серины 335 и 323, которые фосфорилируются на более низких уровнях.

Фиг. 3.

Фосфорилирование серинового остатка 327 задействует серины 323, 331 и 335 для фосфорилирования. (A) Линкерный домен 6His-tag PHF10 (аминокислоты 291–342) и его мутированные варианты были экспрессированы в системе E. coli , очищены и инкубированы с экстрактом HEK293, снабженным гамма- [31] P-ATP. Различные мутированные формы линкерного домена имеют разный уровень сигнала, который зависит от силы сайта фосфорилирования. Очищенный и иммуноокрашенный 6His-линкерный домен PHF10 использовали в качестве контроля загрузки. (B) Частичная последовательность линкерного домена. Серины X-подкластеров-1 и -2 выделены, а NLS-3 отмечен серым прямоугольником и отмечен горизонтальными черными линиями вверху. B-Trcp Degrons-1 и -2 также выделены и отмечены горизонтальными черными линиями под последовательностями. Прайминговые серины 297, 301 и 327 отмечены звездочками, а стрелки от серина 327 указывают на соседние фосфорилированные серины 323, 331 и 335.

Фиг. 3.

Фосфорилирование серинового остатка 327 инициирует фосфорилирование серинов 323, 331 и 335. (A) Линкерный домен 6His-tag PHF10 (аминокислоты 291–342) и его мутированные варианты были экспрессированы в системе E. coli , очищены и инкубированы с экстрактом HEK293, снабженным гамма- [31] P-ATP. Различные мутированные формы линкерного домена имеют разный уровень сигнала, который зависит от силы сайта фосфорилирования. Очищенный и иммуноокрашенный 6His-линкерный домен PHF10 использовали в качестве контроля загрузки. (B) Частичная последовательность линкерного домена. Серины X-подкластеров-1 и -2 выделены, а NLS-3 отмечен серым прямоугольником и отмечен горизонтальными черными линиями вверху. B-Trcp Degrons-1 и -2 также выделены и отмечены горизонтальными черными линиями под последовательностями. Прайминговые серины 297, 301 и 327 отмечены звездочками, а стрелки от серина 327 указывают на соседние фосфорилированные серины 323, 331 и 335.

Для увеличения передачи сигнала посредством фосфорилирования фосфорилированные остатки могут быть организованы в кластеры (Schweiger and Linial, 2010).Фосфорилирование аминокислот в кластере происходит как последовательность, инициируемая фосфорилированием одного серина, который необходим для запуска каскада (Li et al., 2009, 2017; Schweiger and Linial, 2010). В данном случае фосфорилированные серины организованы в два подкластера, которые окружают последовательность, которая содержит сигнал ядерной локализации.

Чтобы определить, зависит ли фосфорилирование серинов в X-кластере друг от друга, мы сначала исследовали часто фосфорилированные серины 297, 301 и 327.Мы получили рекомбинантные формы линкерного домена, которые содержали мутации серинов в первом субкластере (297/301) или во втором (327). Сигнал в киназном анализе снижался только частично, когда серины только одного субкластера были мутированы, в то время как одновременная мутация серинов 297/301 и 327 полностью отменяла фосфорилирование (рис. 3A; сравните строки 1 с 2 и 4 с линией 7). . Это означает, что остатки серина 297/301 и 327 фосфорилируются независимо друг от друга.

Анализ электрофорезной подвижности немутантного и мутированного FLAG-меченного линкерного домена показал, что подвижность линкерного домена с мутациями всех серинов 297, 301 и 327 была ниже, чем для каждого из мутантов в отдельности. Это также подтверждает, что серины 297/301 и 327 фосфорилируются независимо (фиг. 2B; сравните линию 7 с линиями 2 и 4). Таким образом, это подтверждает, что X-кластер PHF10 содержит два независимо фосфорилированных подкластера.

Часто фосфорилированный серин 327 во втором подкластере окружен редко фосфорилированными серинами 323, 331 и 335. Сравнивая их фосфорилирование в киназном анализе и электрофоретической подвижности в геле, мы определили, зависит ли их фосфорилирование от фосфорилирования серина 327. .

Как мы и ожидали, анализ киназы показал, что мутации серинов 323, 331 и 335 не влияли на фосфорилирование серина 327. Они также не влияли на серины 297/301 других субкластеров (фиг. 3A; линии). 3 и 5). В свою очередь, фосфорилирование серинов 323, 331 и 335 во втором субкластере не зависело от фосфорилирования серинов 297/301 в первом субкластере (фиг. 3A; линии 2, 6 и 8).Только дополнительная мутация серина 327 приводит к полному отсутствию фосфорилирования (фиг. 3A; линии 7 и 8; на фиг. 2B линии 2, 6 и 8 аналогичны). Таким образом, фосфорилирование серинов 323, 331 и 335, вероятно, зависит от фосфорилирования серина 327.

Чтобы подтвердить этот результат, мы экспрессировали линкерный домен в клетках HEK293 (фиг. 2B) и определили его подвижность в SDS-PAGE. Мутации серинов 297/301 первого субкластера увеличили его электрофоретическую подвижность (рис.2B; сравните строки 1 и 2), что указывает на снижение фосфорилирования. Мутация часто фосфорилируемых серинов привела к белку с наибольшей электрофоретической подвижностью (фиг. 2B; линия 7), представленным только одной формой, что указывает на полную потерю фосфорилирования.

Мутация серинов 297/301 первого субкластера привела только к частичным отличиям по сравнению с немутантным фрагментом (рис. 2B; сравните строки 1 и 2), так как слабые полосы могут быть обнаружены над основным (нефосфорилированным фрагментом). ) группа.Эти слабые полосы соответствуют фосфорилированным серинам 323, 331 и 335 и исчезают при мутации этих аминокислот (фиг. 2B; линии 3, 5, 8 и 9). Примечательно, что они исчезали, если серин 327 из второго субкластера был мутирован отдельно или вместе с мутациями серинов 293 и 301 (фиг. 2B; дорожка 7). Следовательно, серин 327 второго субкластера был первичной аминокислотой, необходимой для фосфорилирования серинов 323, 331 и 335.

Два подкластера фосфорилирования окружают мотив, который, как предполагается, является последовательностью ядерной локализации (NLS3).Последовательности ядерной локализации обычно содержат несколько положительно заряженных аминокислот (чаще всего аргинин и лизин), которые распознаются белками импортином. Фосфорилирование X-кластера создает сильный отрицательный заряд по обе стороны от NLS3 и, следовательно, может маскировать NLS3 и предотвращать его распознавание импортинами (Fig. 2A).

Во-первых, мы проверили, является ли последовательность NLS3 функциональной и влияет ли на локализацию изоформ.С этой целью мы мутировали NLS3 в одной из PHD, содержащих изоформы PHF10, в которых Х-кластер не фосфорилирован (PHF10-Ps). В мутированном FLAG-меченном PHF10-Ps лизины в последовательности NLS3 были заменены нейтральными аланинами (фиг. 2A).

Эндогенный PHF10-Ps, а также его помеченная FLAG форма присутствовали как в ядрах, так и в цитоплазме. После сверхэкспрессии мутированного Fl-PHF10-Ps-NLS мы не обнаружили каких-либо изменений в уровнях ядерного белка, что указывает на то, что NLS3 не влияет на транслокацию в ядро.Неожиданно количество мутировавшего белка в цитоплазме значительно увеличилось (рис. 4). Сходные результаты были получены после фракционирования клеточных экстрактов на ядерную и цитоплазматическую фракции (рис. 5A, B). Таким образом, мутация последовательности NLS3 приводит к накоплению мутированной изоформы PHF10-Ps в цитоплазме, что указывает на ее повышенную стабильность. Это указывает на то, что эта последовательность не влияет на транслокацию, а требуется для деградации. Таким образом, последовательность NLS3 является функциональной частью белка и участвует в его деградации в цитоплазме.

Рис. 4.

Иммуноокрашивание мутантов FLAG-PHF10-Ps / -Ss и X-cluster / –NLS. Кратковременно экспрессировавшиеся в течение 24 часов в клетках HEK293, изоформы окрашивали антителами против FLAG. Изоформы как PHF10-Ps, так и PHF10-Ss локализованы в ядре и цитоплазме. Мутация NLS не влияла на локализацию изоформ PHF10-Ps и PHF10-Ss. Мутанты NLS- и -X-кластера PHF10-Ps, PHF10-Ss экспрессируются слабее, чем изоформы дикого типа PHF10-Ps (NLS) и PHF10-Ss.

Рис. 4.

Иммуноокрашивание мутантов FLAG-PHF10-Ps / -Ss и X-cluster / –NLS. Кратковременно экспрессировавшиеся в течение 24 часов в клетках HEK293, изоформы окрашивали антителами против FLAG. Изоформы как PHF10-Ps, так и PHF10-Ss локализованы в ядре и цитоплазме. Мутация NLS не влияла на локализацию изоформ PHF10-Ps и PHF10-Ss. Мутанты NLS- и -X-кластера PHF10-Ps, PHF10-Ss экспрессируются слабее, чем изоформы дикого типа PHF10-Ps (NLS) и PHF10-Ss.

Фиг.5.

Субклеточная локализация мутантов FLAG-PHF10-Ps / -Ss и X-cluster / –NLS. (A) Клетки HEK293 трансфицировали изоформами FLAG-PHF10-Ps / Ss и их мутированными вариантами. Через 24 ч клетки фракционировали на цитоплазматическую и ядерную фракции. Белковые экстракты анализировали вестерн-блоттингом. BRG1 и β-тубулин использовали в качестве контролей фракционирования и загрузки. (B) Интенсивность полос на вестерн-блоте определяли количественно с помощью программного обеспечения ImageJ с помощью денситометрии, как описано в разделе «Материалы и методы». Соотношение фракций цитоплазмы и ядра изоформы PHF10-Ps примерно равно, мутации в NLS-3 приводят к накоплению PHF10-Ps (NLS) в цитоплазме. FLAG-PHF10-Ss и его мутировавшие формы имеют одинаковое соотношение между цитоплазмой и ядром, но снижение фосфорилирования в X-кластере (в X-mut и NLS mut) приводит к снижению стабильности изоформы PHF10-Ss. (C) Вестерн-блоттинг немутантных FLAG-PHF10-S и изоформ FLAG-PHF10-S (NLS), обработанных λ-PP для устранения фосфорилирования.FLAG-PHF10-Ss и его мутированная форма NLSmut были визуализированы с использованием антител против FLAG на SDS-PAGE. Разница в подвижности NLSmut по сравнению с FLAG-PHF10-Ss была вызвана заменой положительно заряженных лизинов на нейтральные аланины у мутанта. Мы обнаружили сильный сдвиг полосы в случае PHF10-S (не) и отсутствие сдвига полосы в случае PHF10-S (NLS).

Рис. 5.

Субклеточная локализация мутантов FLAG-PHF10-Ps / -Ss и X-cluster / –NLS. (A) Клетки HEK293 трансфицировали изоформами FLAG-PHF10-Ps / Ss и их мутированными вариантами. Через 24 ч клетки фракционировали на цитоплазматическую и ядерную фракции. Белковые экстракты анализировали вестерн-блоттингом. BRG1 и β-тубулин использовали в качестве контролей фракционирования и загрузки. (B) Интенсивность полос на вестерн-блоте определяли количественно с помощью программного обеспечения ImageJ с помощью денситометрии, как описано в разделе «Материалы и методы». Соотношение фракций цитоплазмы и ядра изоформы PHF10-Ps примерно равно, мутации в NLS-3 приводят к накоплению PHF10-Ps (NLS) в цитоплазме.FLAG-PHF10-Ss и его мутировавшие формы имеют одинаковое соотношение между цитоплазмой и ядром, но снижение фосфорилирования в X-кластере (в X-mut и NLS mut) приводит к снижению стабильности изоформы PHF10-Ss. (C) Вестерн-блоттинг немутантных FLAG-PHF10-S и изоформ FLAG-PHF10-S (NLS), обработанных λ-PP для устранения фосфорилирования. FLAG-PHF10-Ss и его мутированная форма NLSmut были визуализированы с использованием антител против FLAG на SDS-PAGE. Разница в подвижности NLSmut по сравнению с FLAG-PHF10-Ss была вызвана заменой положительно заряженных лизинов на нейтральные аланины у мутанта. Мы обнаружили сильный сдвиг полосы в случае PHF10-S (не) и отсутствие сдвига полосы в случае PHF10-S (NLS).

Мы также предположили, что фосфорилирование X-кластера в изоформах, лишенных PHD, может влиять на функцию NLS3. Подобно PHF10-Ps, эндогенная изоформа PHF10-Ss, лишенная PHD, была обнаружена как в ядрах, так и в цитоплазме, но содержание PHF10-S в цитоплазме было намного выше, чем содержание PHF10-Ps (рис. 4 и 5A, C).

Мы экспрессировали изоформу PHF10-Ss с мутированными серинами 297/301 и 327 X-кластера, устраняя его фосфорилирование [Ss (Xmut)], и провели эксперименты по иммуноокрашиванию. Как и ожидалось, фосфорилирование полностью потеряно в мутированных PHF10-S, и оно мигрировало в виде единой полосы на SDS-PAGE. И флуоресцентная микроскопия, и вестерн-блоттинг показали снижение уровней PHF10-Ss в цитоплазме и ядре (рис. 5B), подтверждая, что отсутствие фосфорилирования X-кластера значительно снижает стабильность изоформы PHF10-Ss. Однако не было изменений в распределении PHF10 между цитоплазмой и ядром (рис. 5B). Эти результаты показывают, что NLS3 не нацеливает PHF10-Ss на ядро, подобно тому, что было показано для изоформы PHF10-Ps.

Чтобы выявить функцию NLS3 в изоформе PHF10-Ss, мы мутировали остатки лизина в последовательности NLS3, аналогично PHF10-Ps-NLS (рис.2А). Распределение мутированного белка в клетке изучали как с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 4), так и путем фракционирования ядра и цитоплазмы. Оба метода показали, что мутация остатков NSL3 не влияет на распределение PHF10 между клеточными компартментами. Однако это привело к значительному снижению PHF10 в ядре и цитоплазме (рис. 4 и 5A, B). Мутация NLS3 также значительно снижает фосфорилирование изоформы PHF10-Ss (рис. 5C).

Чтобы лучше продемонстрировать, что NLS3 необходим для фосфорилирования окружающих серинов X-кластера, белковый экстракт из клеток, трансформированных FLAG-PHF10-S или его мутантной формы, обрабатывали лямбда-фосфатазой. Влияние обработки лямбда-фосфатазой на подвижность изоформ анализировали с помощью SDS-PAGE. Инкубация FLAG-PHF10-Ss с лямбда-фосфатазой привела к существенному изменению его подвижности (фиг. 5C; сравните дорожку 1 и дорожку 2), что указывает на высокий уровень фосфорилирования FLAG-PHF10-Ss. Напротив, версия NLSmut не изменила своей подвижности после обработки лямбда-фосфатазой (рис. 5C; дорожки 3 и 4), что указывает на отсутствие фосфорилирования.

Следовательно, последовательность NLS3 в изоформе PHF10-Ss не влияет на ее клеточную локализацию, но важна для фосфорилирования сериновых остатков X-кластера, которые необходимы для предотвращения деградации Ss-изоформы.

В настоящей статье мы демонстрируем, что область линкерного домена изоформ PHF10-S (X-кластер) состоит из двух независимо фосфорилированных кластеров сериновых остатков. Мы идентифицировали первично фосфорилированные серины и продемонстрировали, что они необходимы для запуска фосфорилирования других серинов в кластере. Два кластера разделены предсказанной последовательностью NLS (NLS3).Однако наши данные показывают, что NLS3 не нацеливает изоформы PHF10 в ядро, но участвует в поддержании их фосфорилирования и стабильности. NLS3 увеличивает скорость разложения PHD, содержащих изоформы PHF10. В изоформах PHF10, лишенных C-концевых PHD, NLS3 важен для фосфорилирования и, следовательно, важен для их высокой стабильности в клетке. В целом эти данные демонстрируют сложный механизм поддержания скорости обновления различных изоформ PHF в клетке.

Изоформы PHF10, у которых отсутствуют домены PHD, фосфорилируются по шести остаткам серина в линкерном домене. Серины в линкерном домене PHF10 (X-кластер) фосфорилируются в изоформах PHF10-S. В свою очередь, X-кластер состоит из двух субкластеров, которые фосфорилируются независимо. Первый подкластер содержит серины 297 и 301, а второй – серины 323, 327, 331 и 335. Два серина первого подкластера и серин 327 второго подкластера активно фосфорилируются независимо друг от друга. .Фосфорилирование серинов 323, 331 и 335 зависит от фосфорилирования серина 327 и не происходит, если этот остаток мутирован в аланин. Таким образом, фосфорилирование серина 327 служит праймером, необходимым для фосфорилирования других серинов в субкластере.

В последовательно фосфорилированных сайтах фосфорилирование остатков происходит в строгом порядке, когда фосфорилирование одного остатка требуется для фосфорилирования следующей фосфорилированной аминокислоты в последовательности (Salazar and Höfer, 2009).Количество скринингов, которые указывают на фосфорилирование серинов во втором подкластере (327, 27; 331, 3; 323, 2; 335, 2), указывает на то, что фосфорилирование происходит последовательно от серина 327 к серинам 331, 323 и 335. .

В недавних публикациях запускаемое последовательное фосфорилирование считается важным механизмом регуляции. Такое фосфорилирование очень координировано и может изменять скорость и чувствительность клеточного ответа на внешние раздражители (Gunawardena, 2005; Mao et al., 2008). Фосфорилирование нескольких сайтов также может служить точкой интеграции для активации и ингибирования сигналов, которые, в свою очередь, определяют судьбу белков и события в передаче сигналов ниже по течению (Nishi et al., 2014). Одним из примеров такого механизма является ДНК-зависимая РНК-полимераза II. Множественное фосфорилирование аминокислот в CTD-домене РНК-полимеразы II определяет стадию цикла транскрипции, в котором она участвует.

Ранее мы показали, что фосфорилирование серинов 297 и 301, а также серинов 327 и 331 во втором подкластере осуществляется казеинкиназой 1 (CK1). В соответствии с этими данными было продемонстрировано, что серины и треонины, организованные в кластеры и фосфорилируемые одними и теми же киназами, обычно расположены в неструктурированных доменах (Schweiger and Linial, 2010), а сайты с эволюционной кластеризацией в 1,4 раза чаще фосфорилируются та же киназа (Freschi et al., 2014). Расстояние между сайтами является критическим для их последовательного фосфорилирования (Kõivomägi et al., 2013).

Ранее мы показали, что фосфорилирование X-кластера приводит к повышенной стабильности изоформ PHF10-Sl и PHF10-Ss по сравнению с PHF10-Pl и PHF10-Ps, в которых X-кластер не фосфорилируется.Было показано, что одной из функций кластерного фосфорилирования является регуляция стабильности и деградации белков (Landry et al., 2014; Varedi K et al., 2010). В соответствии с этими данными, фосфорилирование X-кластера также тесно вовлечено в регуляцию скорости оборота изоформ PHF10 в клетке. PHF10-Ps деградирует быстрее из-за отсутствия фосфорилирования в X-кластере, тогда как фосфорилирование тех же остатков в изоформе PHF10-Ss блокирует его взаимодействие с бета-Trcp и стабилизирует его (Татарский и др., 2017). Здесь мы показываем, что NLS3 также стимулирует деградацию изоформ PHF10-Ps. Мутация потенциального сайта ядерной локализации в PHF10-Ps приводит к накоплению соответствующей изоформы.

В наших экспериментах та же мутация мотива NLS3 PHF10-Ss имела противоположный эффект, приводя к снижению стабильности белка. Однако мы обнаружили, что эта мутация также полностью устраняет фосфорилирование X-кластера, которое, как было показано ранее, защищает PHF10-S от деградации.Трудно четко понять, каким образом мотив NLS3 влияет на фосфорилирование, поскольку в базах данных не указано, выполняет ли он какие-либо дополнительные функции. Можно предположить, что изменение заряда мутантного NLS3 может влиять на вторичную структуру белка PHF10-Ss.

Короткие изоформы PHF10-Ps / -S локализованы как в ядре, так и в цитоплазме, но PHF10-S в основном локализованы в цитоплазме.Из наших данных стало очевидно, что разница в распределении между компартментами определяется разной скоростью разложения.

Количество PHF10-Ps и PHF10-S в ядре было одинаковым. Как мы показали ранее (Brechalov et al., 2014) рекомбинантные PHF10-Ps и PHF10-Ss в ядре включаются в комплекс PBAF. Следовательно, возможно, что изоформы PHF10-Ps в основном включены в комплекс PBAF и важны для его функционирования, в то время как PHF10-Ss, благодаря своей локализации и повышенной стабильности, выполняет функции в цитоплазме.

Белки с близко расположенными сайтами фосфорилирования, объединенными в кластеры, имеют ограниченное количество функций. Для цитоплазматических белков такая организация сайтов типична для белков цитоскелета и белков, регулирующих трансляцию (Schweiger, Linial, 2010). Возможно, что функции PHF10-S в цитоплазме могут быть отнесены к одному из этих классов. Для ядерных белков сильный отрицательный заряд таких кластеров может изменять электростатические взаимодействия таких белков с ДНК (Gunawardena, 2005).

В ядре изоформы PHF10-Ss и PHF10-Sl также фосфорилируются по серинам X-кластера. Таким образом, какие изоформы, PHF10-P или PHF10-S, которые включены в комплекс, могут определять взаимодействия всего комплекса с ДНК и гистонами, а также функционирование комплекса во время ремоделирования хроматина.

Клетки

HEK293 выращивали в среде DMEM с добавлением 10% FBS (HyClone), 2 мМ L-глутамина при 37 ° C, 5% CO. 2 .Клетки HEK293 лизировали в буфере для лизиса: 10 мМ HEPES (pH 7,9), содержащем 5 мМ MgCl, 0,5% Nonidet P-40, 0,45 М NaCl, 1 мМ DTT, коктейль ингибиторов протеаз (PIC) (Roche) и 1% фосфатазу. коктейль ингибиторов 3 (PhIC) (Sigma-Aldrich). Лизат центрифугировали при 10 000 об / мин, 4 ° C в течение 10 мин, и супернатант разбавляли в 4 раза тем же буфером, но без NaCl. Экстракт обрабатывали ДНКазой I (Thermo Fisher Scientific; 0,6 единиц / мл) и РНКазой (Thermo Fisher Scientific; 10 единиц / мл).

Клетки лизировали в буфере FLB (40 мМ Трис-HCl, pH = 7,8; ​​100 мМ NaCl; 2,5 мМ MgCl 2 , 1 мМ DTT; PIC; PhIC) на льду, измельчали ​​в Loose Dounce, центрифугировали в течение 1 мин. и супернатант использовали в качестве цитоплазматической фракции. Осадок ресуспендировали в буфере для лизиса, измельчали ​​в Tight Dounce, инкубировали в течение 10 минут на льду, центрифугировали, как указано выше, и разбавляли таким же образом. Зонды уравновешивали с использованием набора Qubit Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific), смешанного с 4X LB (200 мМ трис-HCl, pH = 6.8; 4% SDS; 40% глицерин; ~ 0,01% бромфенолового синего; 100 мМ DTT) и кипятили при 10 ° C.

В номере: 1 | Объем: 23 | Месяц: февраль

  • Взаимосвязь восприятия и осведомленности об использовании государственных служб поддержки бизнеса (GBSS) в малазийских МСП с точки зрения перспективы

    Автор (ы): Джурия Бинти Шамсуддин, Мохд Собри Бин Минай, Али Юсоб Бин Мд Заин, Салим Аль Идрус

    Аннотация Полнотекстовый PDF