Сравнение белого и бурого медведя по морфологическому признаку: Домашняя работа по биологии по сравнительной характеристике бурого и белого медведя ученика 9 класса “А” Кожухова Дениса.

Белый медведь обладает меньшим количеством копий AMY1B по сравнению с бурым медведем. График в виде прямоугольников и усов гена CN для гена, кодирующего амилазу слюны, AMY1B ( A ). CN взяты из оценок Control-FREEC. Каждая точка представляет собой диплоид CN (ось y ) для данной особи медведя (ось x ). Коробчатая диаграмма отображает медианное значение, первый квартиль и третий квартиль. Усы оттянуты к самой дальней точке цифрой 1.5 × межквартильный размах (третий квартиль минус первый квартиль) из прямоугольника. Черный медведь не включает график ящика и уса, потому что анализ включал только двух особей. ( B ) Тепловая карта, изображающая оценки BDN CN для неперекрывающихся окон 100 пар оснований в локусе AMY2B и AMY1B на каркасе70 (позиции от 1331 300 до 1380 700) эталонного генома белого медведя.

Потеря генов у белых медведей.

Мы наблюдали, что большинство генов, демонстрирующих дифференцированную ХН, имеют более низкую ХН у белых медведей.Чтобы оценить, связано ли это наблюдение в большей степени с изменениями в родословной полярных или бурых медведей, мы сравнили профили CN гена бурых медведей и белых медведей с профилями черного медведя, которые расходились от бурых / белых медведей ∼3,5 до 5 млн лет назад ( 2, 4). В качестве общей оценки профилей CN между видами мы сначала сравнили распределения CN дифференцированных генов между белыми медведями, бурыми медведями и двумя черными медведями. Как и ожидалось, этот анализ выявил статистически значимое различие между белыми медведями и бурыми медведями (критерий Вилкоксона; Control-FREEC P = 9e ^-180 и BDN P = 2e ^-173 ).Более того, этот анализ показал, что, хотя существует также статистически значимая разница между белыми медведями и черными медведями (критерий Вилкоксона; Control-FREEC P = 7e ⁻⁷⁵ и BDN P = 4e ⁻⁷⁵ ), существует Нет такой разницы между бурыми медведями и черными медведями (тест Вилкоксона; Control-FREEC P = 0,38 и BDN P = 0,60). Кроме того, мы выполнили анализ главных компонентов (PCA) по оценкам CN на основе Control-FREEC ( i ) всех генов, ( ii ) дифференцированного набора генов и ( iii ) чрезвычайно дифференцированного набора генов, включая черные медведи (рис. 3). В каждом из трех PCA большинство образцов белых медведей показали четкое разделение от бурых и черных медведей по первому основному компоненту (PC1), причем только PC1 объясняет не менее 50% дисперсии между особями в каждом из трех анализов. (Рис. 3 и SI Приложение , Рис. S7). Более того, особи черного медведя последовательно группировались с особями бурого медведя (рис. 3 и приложение SI, приложение , рис. S7). Мы наблюдали аналогичные результаты, когда PCA выполняли для оценок BDN гена CN ( SI, приложение , рис.S7). Вместе эти результаты показывают, что у бурых и черных медведей больше сходных профилей CN друг с другом, чем с белым медведем, и предполагают, что CNV быстро эволюционировала в линии белых медведей.

Белый медведь демонстрирует разные профили CN по сравнению с бурым медведем и черным медведем. PCA гена CN у всех особей медведей по генам, показывающим соответствие между двумя методами оценки CN. ( A ) Все гены, вариабельные по CN (V _ST > 0; 4698 генов), ( B ) дифференцированные гены (V _ST > 0. 22; 197 генов) и ( C ) высокодифференцированные гены (V _ST > 0,35; 134 гена). Процент отклонения, объясняемый PC1, PC2 и PC3, представлен под каждым графиком.

Обсуждение

Здесь мы провели исследование на уровне популяции, чтобы охарактеризовать полногеномные паттерны CNV у белого медведя и бурого медведя. CNV может управлять экологической адаптацией в течение коротких эволюционных периодов (35–37). Белые медведи и бурые медведи – отличные модели для изучения влияния естественного отбора на CNV, потому что они населяют совершенно разные среды обитания, но настолько недавно разошлись, что по-прежнему способны производить плодовитое гибридное потомство (38, 39).Наш анализ показывает, что CNV обычен в роду Ursus . В среднем ∼140 Mb генома белого медведя и бурого медведя являются CN-переменной, что составляет ∼6% от эталонной сборки генома белого медведя. Эти результаты согласуются с результатами, наблюдаемыми у других млекопитающих (~ 5% у людей, ~ 6,9% у мышей и ~ 4% у коров) (12, 40, 41). Поскольку CNV кажется настолько многочисленным и динамичным в геномах млекопитающих, мы исследовали гипотезу о том, что естественный отбор воздействовал на эту форму генетической изменчивости, чтобы облегчить адаптивные уточнения во время эволюции белого медведя.

Мы идентифицировали 197 генов с дифференцированными профилями CN у белых и бурых медведей. Только 19% этих генов показали более высокий CN у белых медведей, некоторые из которых участвуют в иммунной функции. Гены с функциями иммунного ответа чрезмерно представлены в CN-вариабельных сегментах геномов млекопитающих (14, 29, 32, 42, 43), а дивергенция генов, связанных с иммунитетом, является обычным результатом видообразования (44, 45). Например, у белых медведей по сравнению с бурыми медведями повышено количество CN генов, участвующих в таких иммунных процессах, как распознавание антигена (например,g., IGLV4-60 ) (46), запуск бактериального фагоцитоза (например, CEACAM4 ) (47), выработку цитокинов в ответ на вирусную инфекцию (например, IFNA21 ) (48) и антибактериальная активность в мочевыводящих путях ( RNASE6, ) (49, 50) (рис. 1 и набор данных S2). Мы дополнительно обнаружили несколько больших кластеров генов, содержащих домены V-набора Ig на каркасе332 и каркасе 342, которые присутствуют в нижнем CN у белых медведей (рис. 1 и набор данных S2). Различия, наблюдаемые в иммунном гене CN у белого медведя и бурого медведя, могут указывать на различное давление патогенов, испытываемое после расхождения.

Гены, участвующие в пигментации меха (например, EDNRB , TRMP1 , LYST и AIM1 ), ранее были идентифицированы как примеры недавнего положительного отбора у белого медведя (3, 4). Мы также идентифицировали интересный ген, связанный с мехом, KRTAP21-1 ( Uma_R019359 ), который сильно дифференцировался между видами медведей. KRTAP21-1 участвует в формировании стержней волос и представляет собой кератин-связанный белок (KRTAP), большое и разнообразное семейство генов у млекопитающих (51, 52).Высшее значение CN гена KRTAP21-1 у белых медведей (рис. 1 и SI Приложение , рис. S6) может быть связано с морфологическими различиями, наблюдаемыми между мехом бурого и белого медведя, причем у белого медведя оба более густые. подшерсток и отчетливо ячеистая структура поперечного сечения самого меха (53). Различия как в пигментации меха, так и в структурной морфологии меха, вероятно, являются адаптацией к арктической среде.

Белые медведи адаптировались к диете с исключительно высоким содержанием жира (5, 10), что подтверждается их способностью переваривать жир более эффективно, чем белок (54).Соответственно, ряд генов, вовлеченных в сердечно-сосудистую функцию и метаболизм жирных кислот, демонстрируют признаки недавнего положительного отбора (3, 4). Наши результаты подтверждают этот вывод. Мы идентифицировали различия CN между белыми медведями и бурыми медведями в NOX4 ( Uma_R015975 ), гене, связанном с накоплением жира (55). NOX4 является регулятором метаболического гомеостаза и обнаруживается при более низком CN у белых медведей (среднее CN = 1,88) по сравнению с бурыми медведями (среднее CN = 3,89) (рис. 1, приложение SI, приложение , рис. S6 и набор данных S2). Важно отметить, что NOX4 играет антиадипогенную роль в составе тела (55), что позволяет предположить, что снижение CN NOX4 у белого медведя может быть напрямую связано с потребностью этого вида в увеличении запасов жира. Анализ обогащения генов, дифференцированных по CN, также выявил обогащение генов, участвующих в категориях метаболизма арахидоновой кислоты и эйкозаноидов ( SI Приложение , Таблицы S6 – S9).Эйкозаноиды происходят из арахидоновой кислоты и играют важную роль в воспалении, терморегуляции и сердечно-сосудистой функции (56). Интересно, что большинство дифференцированных генов CN-переменных, участвующих в метаболизме жирных кислот, присутствуют в более низких CN у белых медведей и, возможно, связаны с уникальной скоростью метаболизма белых медведей (57–59).

Другие аспекты нашего анализа способствовали этой связи между диетой, метаболизмом и CNV. Наиболее ярким различием CN, которое мы наблюдали, было повсеместное снижение CN гена OR в линии белых медведей (рис. 1 и набор данных S2). У позвоночных гены OR кодируют рецепторы, связанные с G-белком, а семейство генов OR у млекопитающих может включать более 1000 генов у большинства видов, включая медведей (60–63). Каждый OR настроен так, чтобы реагировать только на определенный набор молекул запаха, при этом разнообразие репертуара OR видов отражает широту его обонятельной хеморецептивной способности (60, 63–65). OR играют важную роль в обнаружении пищи, самок и хищников, а вариации в репертуаре OR между видами могут отражать экологические различия (61, 66).

Для белых медведей Liu et al. (3) ранее идентифицировали два гена OR ( OR5D13 и OR8B8 ) в их основанном на SNP скрининге положительной селекции, что указывает на то, что семейство генов OR было общей мишенью отбора во время эволюции белого медведя. CNV среди OR генов был идентифицирован как потенциальный источник экологической адаптации у многих видов (20, 30, 44, 67⇓ – 69). Это, вероятно, имеет место и в эволюции белых медведей, где давление отбора, направленное на поддержание более разнообразного репертуара операционных, может быть ослаблено менее сложной химической экологией арктических сред (70). Хотя некоторые из сильно дифференцированных CN генов OR были связаны с пищевым поведением, телесным жиром (например, OR7G3 , OR7E24 и OR7G1 ) (71) и размножением ( OR7A5 ) (72) в у людей большинство из них напрямую связано с обонянием (набор данных S2). Таким образом, обоняние белого медведя, по-видимому, эволюционировало, чтобы стать как более специфичным (т.е. менее разнообразный репертуар ОР), так и более острым (т.е. увеличенная площадь поверхности обонятельного эпителия, размещенная за счет увеличенных обонятельных носовых раковин (73)].Обе эти характеристики могут быть уточнены в направлении обнаружения партнеров и добычи на больших расстояниях.

Другие высокодифференцированные гены даже более непосредственно участвовали в сенсорном восприятии и диетическом поведении. Мы также наблюдали меньшее количество копий амилазы слюны ( AMY1B ) (рис. 1 и 2). Высшая амилаза CN является обычным признаком отбора у организмов с рационом с высоким содержанием крахмала (18, 19, 74). Хотя диета белого медведя, вероятно, включает небольшую долю растительного и грибного материала, подавляющее большинство калорий приходится на нерпы (10, 53, 75).И наоборот, у бурых медведей и черных медведей разнообразный всеядный рацион, в котором растительные материалы (например, травы, травы, фрукты, корни и клубнелуковицы) составляют более 70% их рациона (76). Соответственно, ограниченное содержание растительных углеводов в рационе белого медведя, вероятно, привело к потере AMY1B CN. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что снижение CN нескольких генов, имеющих центральное значение для распознавания и обработки рациона, согласуется со сдвигом в сторону гиперплотности у белых медведей.

Наш анализ подтверждает наблюдение, что CNV может способствовать быстрому фенотипическому разнообразию и экологической адаптации (19, 21, 30, 74, 77, 78).Сильное избирательное давление, оказываемое диетой, сформировало популяционные генетические варианты человека (18, 79⇓ – 81), и аналогичные эволюционные процессы, вероятно, сформировали геном белого медведя во время перехода от всеядной диеты к преимущественно плотоядной диете. В согласии с предыдущими исследованиями, мы утверждаем, что естественный отбор, действующий через структурные варианты, может управлять адаптивными уточнениями в течение коротких эволюционных временных масштабов (18, 19, 35, 74, 77, 78, 82–84).

Материалы и методы

Интеллектуальный анализ данных и обработка последовательного чтения.

Мы использовали высококачественный геном белого медведя в качестве основного эталона для картирования (3). Мы загрузили последовательность генома, последовательности белков и аннотации генов из GigaDB (http://gigadb.org/dataset/100008). Мы также использовали геном черного медведя в качестве эталона для картирования (24) для перекрестной проверки наших результатов и ограничения систематической ошибки, которая может быть внесена в результате использования одного эталонного генома. Эталонный геном черного медведя и файл gtf были загружены с ftp://ftp.jax.org/maine_blackbear_project/.Мы загрузили полногеномные данные Illumina с парным концом для 17 белых медведей, 9 бурых медведей и 2 черных медведей с заявленными значениями охвата ≥10 × из архива считывания последовательностей NCBI (номера доступа белых медведей BioSample: SAMN02261811, SAMN02261819, SAMN02261821, SAMN02261826, SAMN02261840, SAMN02261845, SAMN02261851, SAMN02261853, SAMN02261854, SAMN02261856, SAMN02261858, SAMN02261865, SAMN02261868, SAMN02261870, SAMN02261871, SAMN02261878 и SAMN02261880, бурый медведь н. у.к. биопробы присоединяющиеся .: SAMN02256313, SAMN02256315, SAMN02256316, SAMN02256317, SAMN02256318, SAMN02256319, SAMN02256320, SAMN02256321 и SAMN02256322; номер доступа BioSample черного медведя.: SAMN01057691 и SAMN10023688) (2, 3, 24). Мы выполнили качественную обрезку для каждого образца с помощью Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/). Остаточные последовательности адаптеров удаляли из считываний, и считывания обрезали так, чтобы они содержали минимальную оценку качества 30 в каждом положении нуклеотида. Мы отбрасывали обрезанные прочтения короче 50 нуклеотидов.

Оценка CNV.

Качественные и обрезанные адаптером считывания последовательностей с парным концом Illumina были независимо сопоставлены с эталонными геномами белого и черного медведя с использованием «чувствительных» предустановленных параметров в bowtie2 (85).Файлы выравнивания SAM были преобразованы в отсортированный формат BAM с использованием функций просмотра и сортировки в samtools (86). Мы использовали подход на основе глубины чтения, реализованный в Control-FREEC, для оценки целочисленных CN для каждого окна размером 10 кб с размером шага 2 кб по всему геному (25). Варианты CN не были предсказаны в эталонных каркасах <10 т.п.н. Мы использовали следующие параметры в Control-FREEC: breakPointThreshold = 0,8, coefficOfVariation = 0,062, minExpectedGC = 0,35, maxExpectedGC = 0,55, степень = 3 и telocentromeric = 0.Из выходных данных Control-FREEC и файлов координат генов мы использовали собственный сценарий Perl для идентификации генов, которые полностью перекрывались вариантами CN (сценарий доступен по адресу https://github.com/DaRinker/PolarBearCNV). Хотя это и нечасто, мы наблюдали несколько случаев генов с более чем одной оценкой CN. Эти редкие события произошли из-за несовершенной оценки точек останова с учетом разрешения нашего размера окна и скользящего окна, что привело к перекрытию границ между концом одного CNV и началом следующего CNV.В этих случаях мы использовали среднее значение CN. Кроме того, мы использовали независимый подход на основе глубины чтения (BDN) для оценки CN гена. Этот подход аналогичен нашей предыдущей работе и работе других (26, 27, 87, 88). Для каждого образца мы извлекли координаты гена, кодирующего белок, из эталонного файла gff белого медведя и рассчитали средние значения покрытия для каждого гена, используя функцию глубины samtools. Среднее значение всех средних значений охвата генов использовалось как нормализующий коэффициент, представляющий диплоидный CN, равный двум.CN гена рассчитывали следующим образом: Число копий гена = x¯gene depthx̃depth всех генов × 2.

Идентификация генов, дифференцированных с помощью CN между белым медведем и бурым медведем.

Мы рассчитали V _ST для выявления расходящихся профилей CNV между популяциями белого и бурого медведя (32). V _ST – это измерение, специфичное для данных мультиаллельного генотипа, таких как микросателлиты и варианты CN, и аналогично F _ST . И V _ST , и F _ST рассматривают, как генетическая изменчивость может разделять группы (популяции или близкородственные виды) (32) и варьироваться от 0 (нет дифференциации между группами) до 1 (полная дифференциация между группами).Мы рассчитали V _ST следующим образом: VST = (Vtotal- (Vполярный медведь × Nполярный медведь + V коричневый медведь × N коричневый медведь)) / NtotalVtotal,

, где V _total – общая дисперсия; V _{полярный медведь} и V _{коричневый медведь} – дисперсия CN для популяций белого и бурого медведя, соответственно; N _{полярный медведь} и N _{коричневый медведь} – размер выборки для популяций белого и бурого медведя, соответственно; и N _total – общий размер выборки.V _ST был рассчитан для скользящих окон геномных бункеров размером 10 т.п.н. с размером шага 2 т.п.н. по эталонному геному белого медведя ( SI Приложение , рис. S2). Мы также независимо вычислили V _ST для всех генов, используя оценки CN гена, полученные с помощью Control-FREEC и нашего метода BDN ( SI, приложение , рис. S4).

Тестирование перестановок для дифференциации V

Чтобы определить, какие гены демонстрируют наибольшую наблюдаемую степень межвидовой изменчивости CN, которая, вероятно, не связана с систематической ошибкой выборки, мы выполнили тесты на перестановку подсчетов CN.Здесь мы случайным образом переставили всех особей бурого и белого медведя и вычислили новый V _ST для каждого гена. Этот процесс повторяли 1000 раз, создавая распределение значений V _ST для каждого гена (сценарий R доступен на https://github.com/DaRinker/PolarBearCNV). Затем мы отобрали те гены, у которых наблюдаемый V _ST упал выше 95-го и 99-го перцентилей пермутированного распределения V _ST . Эти гены демонстрируют сильную внутривидовую гомогенность CN, а также высокую степень межвидовой дифференциации ( SI Приложение , рис. S6). Наконец, мы взяли максимальное пермутированное значение V _ST , наблюдаемое в 95-м и 99-м процентилях всех генов, чтобы установить стандартное пороговое значение для всего генома (максимальный 95-й процентиль: V _ST > 0,22; максимальный 99-й процентиль: V _ST > 0,35) для всех последующих анализов. Значения гена V _{, ST} считались значимыми, когда наблюдаемые значения V _{, ST} были выше максимального порогового значения 95% доверительного интервала в обоих методах оценки CN гена.

Классификация белковых доменов и обогащение генов.

Мы использовали hmmscan для предсказания белковых доменов (33) и ShinyGO v0.50 для выполнения функционального обогащения набора генов CN-переменных, гомологичных геному человека (т.е. генов с идентификаторами генов Ensembl) (89).

PCA гена CN.

Мы выполнили PCA на гене CN, чтобы оценить, достаточно ли общего CNV для разделения видов белого медведя, бурого медведя и черного медведя. PC были рассчитаны с использованием функции prcomp в R с использованием матрицы данных, содержащей CN генов во всех проанализированных образцах медведей (90).Счетчики CN были сначала масштабированы и центрированы перед вычислением на ПК. Независимый анализ был проведен на полном наборе генов с информацией CN (21 142 гена), а также на подмножествах генов с пороговым значением V _ST , равным 0,22 (197 генов) или 0,35 (134 гена) (рис. SI Приложение , Таблица S8).

Благодарности

Мы благодарим Шипинга Лю и Зиджун Сюн за информацию относительно эталонного генома белого медведя, Элизабет Вестон за полезные комментарии к этой рукописи и двух анонимных рецензентов за конструктивные предложения по более ранней версии этой рукописи.

Сноски

• Авторы: D.C.R., N.K.S., S.Z. и J.G.G. спланированное исследование; D.C.R., N.K.S., S.Z. и J.G.G. проведенное исследование; D.C.R., N.K.S., S.Z. и J.G.G. проанализированные данные; и D.C.R., N. K.S. и J.G.G. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1

  3116/-/DCSupplemental.

Идентификация медведя (Служба национальных парков США)

NPS Photo / Национальный парк и заповедник Лейк Кларк / Джим Пфайффенбергер

Коричневый и гризли – общие названия одного и того же вида, Ursus arctos ; разница между ними – географическое положение, которое влияет на диету, размер и поведение.Те, что живут в прибрежных районах Аляски, называются бурыми медведями, в то время как обычно внутренние медведи, которые имеют ограниченный доступ или не имеют доступа к кормовым ресурсам морского происхождения, часто меньше по размеру и называются гризли. Оба имеют одинаковую отличительную форму тела, описанную ниже.

• Отчетливая горбинка на плече.
• Крупа ниже бугорка.
• Профиль лица кажется выпуклым между глазами и кончиком морды.
• Уши короткие, круглые.
• Передние когти слегка изогнуты и имеют длину 2–4 дюйма, в зависимости от того, сколько копает отдельный медведь.
• Пальцы плотно прилегают друг к другу и образуют очень прямую линию. Линия, проведенная под большим пальцем ноги через верхнюю часть подушечки, проходит через нижнюю половину мизинца или под ним на следах гризли / бурого медведя. Следы когтей часто видны на следах.
• Бурые медведи крупнее черных медведей: они стоят на четвереньках на 3-5 футов в плечах.

NPS Photo / Национальный парк и заповедник Лейк Кларк / J.Mills

Американские черные медведи ( Ursus americanus ) – наиболее распространенный и широко распространенный вид медведей в Северной Америке. Их можно найти где угодно, от лесных массивов до пляжа и альпийской зоны.

Однако название «черный медведь» вводит в заблуждение. Этот вид может варьироваться от черного до серого, от коричного до белого в зависимости от местоположения и человека. Чтобы правильно идентифицировать американского черного медведя, не полагайтесь на его окраску.Вместо этого ищите комбинацию следующих функций.

• Плечо лежит ровно или ровно со спиной / без плечевого горба.
• Круп выше передних плеч.
• Профиль лица прямой от между глазами до кончика морды.
• Уши выше, овальной формы и могут казаться очень заметными на голове.
• Передние клешни меньше 2 дюймов в длину и изогнуты.
• Пальцы раздвинуты и довольно изогнуты.Линия, проведенная под большим пальцем ноги через верхнюю часть подушечки, проходит через верхнюю половину мизинца на следах черного медведя. Следы когтей не всегда видны на следах.
• Черные медведи меньше бурых медведей, их рост от 2 до 3,5 футов в плечах на четвереньках.

Иллюстрация предоставлена ​​Йеллоустонским национальным парком

Пытаясь идентифицировать медведя, не полагайтесь только на цвет и размер, поскольку они могут ввести в заблуждение. Вместо этого используйте следы и внешний вид медведя, чтобы определить, бурый это медведь / гризли или американский черный медведь.

Геномы полярных и бурых медведей выявляют древние примеси и демографические следы прошлых изменений климата

Исследования видообразования и примесей в масштабе генома стали важными инструментами в эволюционном анализе недавно разошедшихся ветвей. Например, меняющие парадигму геномные исследования архаичных и анатомически современных людей выявили критические события потока генов в истории гомининов (1, 2). Однако, помимо нескольких анализов одомашненных видов и их диких родственников (например,г., исх. 3), только сейчас начинают появляться исследования, в которых для изучения примесей в популяциях диких животных используется секвенирование всего генома.

Семейство медведей (Ursidae, Mammalia) представляет собой превосходную, в значительной степени неиспользованную модель для исследования сложного видообразования и быстрой эволюции отдельных фенотипов. Хотя белые медведи (PBs; Ursus maritimus ) и бурые медведи ( Ursus arctos ) считаются отдельными видами, анализ ископаемых остатков и данных о митохондриальной последовательности показал недавнее расхождение PB у бурых медведей (рассмотрено в исх.4). Например, филогенетический анализ полных митохондриальных геномов, в том числе уникальной челюстной кости возрастом от 130000 до 110000 лет на Шпицбергене, Норвегия, подтвердил особенно тесную связь между PB и генетически изолированной популяцией бурых медведей из Адмиралтейства, Баранова, и острова Чичагоф на архипелаге Александра на Аляске (далее – бурые медведи ABC) и предложили разделение их материнских линий примерно на 150 тыс. лет назад (4). Это недавнее расхождение и парафилетические отношения вызывают вопросы, было ли достаточно времени для развития полной репродуктивной изоляции (5). Несмотря на то, что они являются полностью разными видами на большей части их ареалов (6), скрещивание белых и бурых медведей происходило в неволе (7), и, хотя они чрезвычайно редки, недавно были зарегистрированы естественные гибриды. Действительно, ограниченные данные по коротким участкам митохондриальной ДНК предполагают, что гибридизация могла произойти между полярными и бурыми медведями вскоре после того, как они разошлись друг с другом (8). Однако для критической оценки этой возможности и, в частности, для определения того, какая часть существующего генома медведя была сформирована потоком генов между бурыми медведями и PB, требуются дополнительные свидетельства от двурядной наследуемой ядерной ДНК.Хотя данные о последовательностях ядерной ДНК недавно показали, что PB, возможно, стали генетически отличными от бурых медведей примерно на 600 тыс. Лет назад (9), подход секвенирования отдельных ядерных маркеров «ген за геном» явно не обладает достаточной мощностью для обнаружения потенциальной древней примеси.

Хотя полевые и молекулярные исследования дали важную информацию об экологии и эволюционных отношениях PB, успехи в технологии секвенирования следующего поколения только недавно сделали возможными полногеномные исследования таких видов диких животных (10, 11).Полногеномный анализ PB может предоставить более полную картину его эволюционной истории, возможные признаки примесей и ключи к разгадке генетической основы адаптивных фенотипических особенностей, облегчающих жизнь в Арктике, что необходимо для лучшего понимания возможных реакций на текущие и будущие климатические изменения.

Мы собрали обширные данные о последовательности генома из образцов современных полярных, бурых и американских черных медведей, а также ПБ возрастом около 120 000 лет, чтобы ответить на следующие вопросы.( i ) Какая более точная ассоциация между PB и родственными ему видами, бурым медведем; и находим ли мы какие-либо признаки прошлого генетического обмена между двумя видами? ( ii ) Действительно ли РВ эволюционировала недавно, как предполагают митохондриальная ДНК и ископаемые останки, или она имела более древнее происхождение, как показывают локусы ядерной ДНК? ( iii ) Можем ли мы вывести какие-либо прошлые отклики в истории популяции древних медведей, которые могут быть связаны с климатическими изменениями? Наш сравнительный геномный анализ облегчил изучение сроков дивергенции и гибридизации коричневых линий и линий PB в течение последних 4-5 миллионов лет климатических изменений и предоставил окно в генетические основы адаптивных особенностей, позволяя начать исследование уникальные характеристики PB и то, как они могут отражать его превосходную адаптацию к экстремальным условиям Арктики.

Результаты и обсуждение

Секвенирование в масштабе генома трех видов медведей.

Мы выполнили глубокое секвенирование генома ( SI Приложение ) для PB (далее «PB7»), двух бурых медведей ABC («ABC1» и «ABC2»), бурого медведя, не относящегося к ABC («GRZ»). , и американский черный медведь ( Ursus americanus , в дальнейшем именуемый черным медведем). Мы создали от 25 до 100-кратного покрытия для каждого из этих лиц, с самым глубоким охватом для PB ( SI Приложение , Таблица S1).Мы собрали 3,15 миллиарда операций чтения для PB7 с помощью SOAPdenovo (12). Информация о парах спаривания дала 1229681 каркас и контиг с длиной N50 61 т.п.н. и размахом в 2,53 миллиарда оснований (ГБ), что близко к предполагаемому размеру генома гигантской панды (2,4 ГБ) (13). Данные последовательности генома с низким охватом, от трех до 10 для каждой, были получены для дополнительных 22 PB ( SI, приложение , таблица S1). В качестве средства проверки сборки PB и повышения эффективности ядерных геномных последовательностей мы также секвенировали транскриптомы отдельных полярных и бурых медведей ( SI Приложение , Таблица S2).

Мы сопоставили показания всех 27 человек с нашей сборкой PB и провели поиск геномных позиций, в которых можно было бы уверенно идентифицировать два разных нуклеотида ( SI Приложение ). Мы называем такие положения SNP, даже если разные нуклеотиды могут принадлежать к разным видам, например, нуклеотид, зафиксированный в PB, но отличающийся от ортологичного нуклеотида черного медведя. Эта процедура дала 13 038 705 SNP, из которых 2 540 010 являются полиморфными в PB. Мы создали второй набор SNP, сопоставив показания со всех образцов с геномом собаки (сборка Canis ownis , версия 2.0) и применяя ту же процедуру вызова SNP. В результате этого подхода было получено 12 023 192 SNP, из которых 1 914 757 являются полиморфными среди PB. Этот последний набор содержит немного меньшее количество вызовов SNP (по сравнению с использованием сборки PB), что может быть результатом удаления участков генома в линии собачьей линии после разделения между собакой и медведем. Однако SNP, основанные на геноме собаки, выигрывают от превосходных аннотаций генов, которые упрощают идентификацию синонимичных и несинонимичных кодирующих SNP с хорошей надежностью и позволяют картировать SNP в соответствующие места на хромосомах собаки. Наличие двух наборов SNP, полученных с помощью разных, но дополняющих друг друга подходов, помогло нам оценить надежность наблюдений, сделанных ниже. Среди обнаруженных нами SNP 26 001 приводят к заменам аминокислот [полиморфизмы отдельных аминокислот (SAP)], что связано с кодирующими областями предположительно ортологичных генов, известных из генома собаки (canFam2). Было обнаружено, что из этих SAP 7014 возможно или вероятно «повреждают» согласно расчетам, то есть якобы вызывают функциональные изменения белка ( SI Приложение ).Количество аллелей во всех полиморфных локусах SNP и количество высококачественных полиморфных аллелей SAP, общих для трех видов медведей (рис.1), демонстрируют значительное количество фиксированных аллелей внутри каждого вида, а также большее количество общих аллелей между полярный и бурый медведь и бурый и черный медведь, чем между полярным и черным медведем. Относительно меньшее общее количество аллелей у черного медведя, однако, может быть связано с меньшим охватом последовательностей по сравнению с двумя другими глубоко секвенированными видами ( SI Приложение , Таблица S1).

Число аллелей, уникальных и общих для трех видов медведей – полярного, бурого и американского черного медведя – во всех локусах SNP ( A ) и высококачественных полиморфных вариантах, приводящих к SAP ( В ).

Мы также получили 164 ГБ данных последовательности без усиления для образца PB от 130 000 до 110 000 лет из Свальбарда, Норвегия ( SI Приложение , Таблица S1). Последовательности, считанные от этого древнего медведя, были сопоставлены с нашей сборкой генома PB, и для 3293332 SNP мы могли уверенно определить по крайней мере один аллель в древнем образце.Мы наблюдали 16 338 аллелей в образце древних PB, которые были похожи на аллели трех бурых медведей, но не на современные аллели PB. Используя SNP, основанные на сборке собак, мы определили один или оба аллеля для 2 837 892 SNP в древней выборке и обнаружили 15 527 древних аллелей PB, которые были идентичны аллелям у бурых медведей, но не у современных PB.

Несоответствие митохондриальной и ядерной эволюционных историй.

Фундаментальный вопрос в эволюции PB касается точной природы его тесной связи с бурым медведем.Для всех секвенированных особей медведей, даже с низким средним охватом ядерного генома, у нас было достаточно данных для сборки их митохондриальных геномов. Филогенетический анализ ( SI Приложение ), который также включал ранее собранные и общедоступные митохондриальные геномы ( SI Приложение , Таблица S3), подтверждает, что бурые медведи ABC с этими данными более тесно связаны с PB, чем с другими бурыми медведями. (Рис.2 A ). Таким образом, материнские отношения между этими видами медведей не следуют таксономическим границам.Для дальнейшего изучения загадочного филогенетического положения бурых медведей ABC мы реконструировали филогенетическое дерево на основе полногеномных SNP из ядерных аутосомных локусов. Эти маркеры демонстрируют паттерн, отличный от митохондриального генома: две особи бурого медведя ABC, которые группируются вместе, по их морфологии, более близки к бурому медведю, не относящемуся к ABC (GRZ), чем к PB (рис. 2). В ). Более того, эти анализы подтверждают, что древние группы ПБ являются родственными всем современным ПБ, взятым в пробы, включая современных медведей со Свальбарда, в Баренцевом море (4).Хотя это демонстрирует, что древний PB действительно наиболее тесно связан с современными PB, важно, что существующие PB на Свальбарде более тесно связаны с существующими PB с Аляски, чем с этой вымершей линией Svalbard. Хотя для подтверждения необходимы данные по более существующим и вымершим ПБ, эти отношения подтверждают гипотезу об исчезновении и замене более ранних линий-предшественников в популяции ПБ Баренцева моря и, возможно, всего существующего генетического фонда ПБ.

Филогенетическая реконструкция взаимоотношений медведей. ( A ) Байесовское дерево максимальной достоверности клады, реконструированное из митохондриальных геномов (мтДНК), с закрашенными черными кружками в отдельных узлах, указывающими апостериорную вероятность больше 0,99 и поддержку бутстрапа более 99% (диагональные линии указывают на усеченные ветви, и для этой цели из дисплея, геномы пещерного медведя были исключены; SI Приложение , рис. S5, показывает полное дерево). ( B ) Соседнее дерево генетических расстояний, вычисленное по ~ 12 миллионам маркеров SNP ядерного генома (nuDNA).

Явное несоответствие между митохондриальным и ядерным геномами в филогенетическом расположении бурых медведей ABC (рис. 2 и 3) отражает, что обнаруживается в эволюционных историях архаичных и анатомически современных человеческих линий (2). Точно так же мы предполагаем, что эти закономерности могут быть объяснены двумя основными эволюционными сценариями. Во-первых, бурые медведи ABC и PB могут иметь общую материнскую историю в результате смешения предков этих двух линий с последующим захватом митохондриального генома одного медведя другой медвежьей линией.Несоответствие также может быть результатом случайного набора наследственных генетических линий из-за генетического дрейфа (неполная сортировка по линиям), который, возможно, позволил дивергентным митохондриальным линиям выжить, возможно, в небольших изолированных популяциях медведей, в то время как они теряются в других. Также было высказано предположение, что филогения, выведенная из данных о последовательностях нерекомбинирующихся хромосом, таких как митохондриальная ДНК, может быть искажена отбором (14). Таким образом, мы проверили доказательства положительного отбора в 13 генах, кодирующих белок митохондриального генома, используя набор данных из 36 бурых медведей и PBs ( SI Приложение ).Результаты нашего анализа не продемонстрировали никаких доказательств положительного отбора на ветвях, ведущих к ABC бурого медведя плюс PB, ни к самому PB, за исключением гипотезы о том, что избирательное сканирование митохондриальной ДНК может быть основной силой в развитии материнских эволюционных отношений между бурыми медведями и PB .

Филогенетические разногласия и расхождения среди медведей. Схематическое дерево видов (черный контур) подчеркивает несоответствие между мтДНК и ядерной историей, а оранжевая пунктирная линия представляет дерево генов мтДНК.На рисунке показана интрогрессия и замена (отмечена знаком X) митохондриальной ДНК PB митохондриальным геномом бурого медведя ABC, хотя с этими данными нельзя исключить противоположный сценарий, то есть захват митохондриального генома PB у современного бурого медведя ABC. Показаны две гипотезы разделения и смешения клонов, основанные на скрытой модели Маркова слияния: ( i ) древнее разделение (4–5 млн лет назад) между линией черного медведя и бурого медведя / PB, за которым следует прерывистый поток генов (серый затенение), оканчивающиеся от 200 до 100 тыс. лет назад, и ( ii ) аналогичное древнее разделение между PB и бурыми медведями с последующим обширным потоком генов (серая заливка) между бурыми медведями ABC и PB до самого недавнего времени.Линия древнего PB обозначена как вымершая.

ПБ Дивергенция и сигналы примеси.

Чтобы сделать выводы о временах расщепления и потоке генов, мы применили модель скрытого слияния Маркова к четырем нашим геномам медведя с глубоким охватом: PB, одному бурому медведю ABC, бурому медведю не-ABC и черному медведю. Сначала мы использовали простую модель изоляции (15), сравнивая пары геномов в предположении аллопатрического видообразования. Однако для всех сравнений мы получили оценки совсем недавнего времени разделения и очень больших предков эффективных размеров популяции ( N _e ), что согласуется с неправильной спецификацией демографической модели и предполагает, что настоящая демография не является простым разбиением. но вместо этого начальные расщепления, за которыми следуют длительные периоды структурирования популяций и потока генов.Поэтому мы применили расширенную модель, оценивающую начальное время разделения, за которым следует период потока генов до полного разделения ( SI Приложение ). Мы оценили первоначальный раскол между черными медведями и их сестринской линией от 4 до 5 млн лет назад с последующим потоком генов до 100–200 тыс. Лет назад (рис. 3). Эта оценка времени разделения находится в пределах диапазона ранее сообщенных оценок, основанных на молекулярных данных ( SI Приложение , Таблица S4). Внутри линии происхождения бурый медведь / PB оценка их начального раскола имела бимодальное временное распределение, что указывает на совсем недавнее раскол или раскол, близкий к расколу с черным медведем ( SI Приложение , рис.S11). Оценка прекращения потока генов между полярными медведями и бурыми медведями ABC существенно не отличалась от 0 лет. Хотя расширенная модель может не полностью отражать основную демографию, и необходим дальнейший анализ, этот результат наиболее согласуется с гипотезой о древнем начальном расколе между бурыми медведями и ПБ примерно в то же время, что и бурый медведь против черного, примерно 4%. 5 Mya, за которым следует период полного разделения ветвей (или одного с очень небольшим потоком генов), а затем и недавнее смешивание.Примечательно, что эти древние расщепленные оценки примерно в 5 млн лет назад совпадают с границей миоцена и плиоцена, периодом изменения окружающей среды, который, возможно, вызвал излучение видов медведей (16), и что многолетний морской лед, возможно, обеспечивающий подходящую полярную среду обитания, существует в центральной части Северного Ледовитого океана со среднего миоцена (17).

Для дальнейшего изучения возможных сигналов примеси у бурых медведей и PB мы искали интервалы в геномах бурого медведя ABC, которые больше похожи на таковые у бурых медведей, чем у бурых медведей, не принадлежащих к ABC (т.е., те, которые являются «PB-подобными», а не «GRZ-подобными»). Сначала мы оценили фракции двух секвенированных геномов бурого медведя ABC, которые являются PB-подобными, с помощью анализа главных компонентов (PCA) данных SNP (18, 19) ( SI Приложение ). Хотя этот анализ показывает значительное разнообразие между двумя бурыми медведями ABC (рис. 4 A ), он оценивает, что 5,5% генома ABC1 и 9,4% генома ABC2 являются PB-подобными. Если мы применим тот же подход к бурому медведю, не относящемуся к категории ABC (т.е., GRZ), только ∼1,5% его генома является PB-подобным.

Возможная примесь полярных медведей и бурых медведей ABC. ( A ) График PCA, показывающий две «проекции», которые дают оценки смешанных фракций. Причина, по которой выступы не образуют прямые углы, обсуждается в Приложении SI . ( B ) Карта примесей, соответствующая хромосоме 11 собаки, для двух бурых медведей ABC. Масштаб указан в единицах 10 миллионов базисов. Красные области обозначают хромосомные области, общие с бурыми медведями, не принадлежащими к группе ABC, а синие области указывают, где одна или обе хромосомы являются общими с PB ( SI Приложение , рис.S12, показывает полную карту). ( C ) Увеличение B , которое включает интервал 250 т. п.н., в котором обе хромосомы у бурых медведей ABC очень похожи на хромосомы наших секвенированных PB. Область содержит четыре гена, включая ортолог ALDH7A1 , который может быть связан с солеустойчивостью ( SI Приложение ). Вертикальная ось – P – Q , где P – это вероятность генерации генотипа, наблюдаемого в ABC2, с учетом генотипов, наблюдаемых в PBs, а Q – это вероятность предполагаемых аллелей у бурого медведя, не относящегося к ABC (GRZ).Таким образом, SNP с положительным значением свидетельствует о том, что ABC2 является PB-подобным в этой области, тогда как отрицательное значение предполагает, что ABC2 генетически подобен бурому медведю, не относящемуся к ABC.

Затем мы разделили аутосомы в двух геномах бурого медведя ABC на интервалы, которые являются PB-подобными ни в одной, ни в одной, ни в обеих хромосомах ( SI Приложение ). Мы нанесли на карту эти интервалы (Рис.4 B и SI Приложение , Рис. S12), по которым было оценено, что 7,5% генома ABC1 и 10.6% генома ABC2 являются PB-подобными, что разумно согласуется с анализом на основе PCA (моделирование показывает, что инструмент PCA систематически занижает фракцию примесей; SI Приложение ). Важно отметить, что многие из PB-подобных интервалов, вероятно, слишком длинные и слишком расходятся между двумя секвенированными бурыми медведями ABC ( SI Приложение , рис. S12), чтобы их можно было легко объяснить сортировкой по наследственным линиям, поскольку рекомбинация должна была фрагментировать эти области. с течением времени (20). В некоторых случаях интервалы составляют примерно четыре миллиона оснований в длину и в большинстве случаев PB-подобны в одном буром медведе ABC и GRZ-подобны в другом ( SI Приложение , рис.S12). Таким образом, недавняя геологически недавняя примесь вызывает доверие для объяснения закономерностей, наблюдаемых в ядерных и митохондриальных данных.

Карты примесей (рис. 4 B и SI Приложение , рис. S12) также могут быть использованы для идентификации участков генома, введенных в линию медведя путем примеси и, возможно, предпочтительно удерживаемых селективными силами (21). Недавно было высказано предположение, что современные люди могли унаследовать аллели, важные для иммунной функции, от выгодного древнего события смешения с архаичными людьми (22).Один такой интервал с селективным потенциалом у медведей содержит гомолог ALDH7A1 . Было показано, что этот ген защищает людей от гиперосмотического стресса (23), и вполне возможно, что PB-подобные варианты могли обеспечить селективное преимущество для PB и прибрежных бурых медведей, таких как бурые медведи ABC, при переходе к морскому окружающей среды (Рис.4 C и SI Приложение ).

Дифференциация популяций PBs и бурых медведей.

Чтобы оценить, подходят ли образцы примеси, выявленные в результате анализа набора данных SNP по всему геному, для более широкого географического диапазона бурых медведей и PB, мы расширили нашу выборку, включив в нее особей с трех разных континентов (рис. 5 А ). Мы выбрали подмножество из 100 SNP (идентифицированных по последовательностям генома древних PB и 23 современных PB) и амплифицировали и генотипировали эти SNP у 118 медведей, включая 58 особей PB и девять ABC и 51 бурого медведя, не относящегося к ABC ( SI Приложение , таблица S5). Анализ этого набора данных на уровне популяции показывает, что, хотя бурые медведи ABC ближе к другим бурым медведям, чем к PBs (рис. 5 B ), некоторые особи разделяют до 11% своего генетического фона с PB (рис. .5 C ), что согласуется с приведенными выше оценками. Вдобавок два современных PB разделяют до 20% своего генетического фона со всеми бурыми медведями, тогда как древний PB разделяет целых 25% (Рис. 5 C ).

Анализ на уровне популяции 118 бурых медведей и ПБ. ( A ) Примерное географическое расположение образцов. Синяя заливка представляет текущий известный диапазон PB, а более темная заливка указывает на более высокую плотность. ( B ) График PCA основан на генотипах из ~ 100 SNP.Цвета и символы для образцов указаны в легенде для A , с треугольниками, представляющими современные PB. ( C ) Анализ структуры бурых медведей, бурых медведей ABC и PB с числом генетических популяций, установленным на 2, что указывает на низкие уровни примесей, присутствующих в геномах некоторых медведей ABC и PB (черная стрелка указывает положение древний ПБ). ( D ) Структурный анализ с количеством генетических популяций, установленным на 3 для 58 PB из всего их диапазона.

Далее, чтобы исследовать, можно ли использовать обнаруженные нами SNP для обнаружения генетической структуры популяции внутри PB, мы проанализировали подмножество данных, представляющих только современных особей PB. В результате секвенирования генома мы идентифицировали 2 540 010 полиморфных SNP среди PB, что мало по сравнению с числом, обнаруженным при сопоставимых данных от людей, относительно мономорфных видов ( SI Приложение ). Расчетный средний индекс фиксации ( F _ST ) между пятью Аляскинскими ПБ (как одна популяция) и шестью ПБ Шпицбергена (Баренцево море) с самым высоким охватом (ПБ1–4, 6 и 8, как вторая популяция) было всего 0.0785. Для сравнения, применяя ту же процедуру к аналогичному набору данных по пять человек из каждой из двух групп людей, европейской и азиатской, мы обнаружили, что среднее значение F _ST составляет 0,1928, что указывает на значительно меньшую дифференциацию между двумя популяциями PB. . Однако наш PB F _ST может быть недооценен для вида в целом, поскольку две выбранные популяции представляют только часть глобального генетического разнообразия, предполагаемого микросателлитными данными (24).

Несмотря на относительно низкое генетическое разнообразие PB, наш набор данных SNP, представляющий более широкую географическую выборку, указывает на присутствие генетической структуры среди нескольких существующих популяций PB ( SI Приложение ). F _ST находился в диапазоне от 0,004 до 0,105 ( P <0,005) среди всех пар популяций, за исключением ПБ из Южного морей Бофорта и Чукотского морей ( F _ST = 0,004, P = 0,2; SI Приложение , Таблица S7), которые также группируются вместе в PCA и байесовском кластерном анализе (рис.5 B и D ) по сравнению с паттернами, идентифицированными с использованием 16 микросателлитных локусов (24). Однако ПБ из Баренцева моря (Шпицберген) и из южной части Гудзонова залива, Канада, оба значительно отличаются от группы Аляски (рис. 5 D ). Эти результаты демонстрируют, что наш набор ядерных SNP, в отличие от разреженных данных о ядерных интронах, которые не демонстрируют подобную структуру (9), может быть полезен для глобального популяционного генетического анализа PBs.

Медведь Демографическая история и палеоклиматические данные.

Глубоко секвенированные геномы, такие как те, о которых мы сообщаем здесь, позволяют относительно надежно идентифицировать гетерозиготные положения и использовать недавно разработанный геномный коалесцентный анализ, предназначенный для оценки прошлой структуры популяции. Мы применили метод, основанный на модели попарного последовательного марковского слияния (PSMC) (25), чтобы оценить исторические колебания в N _e на основе распределения времени, прошедшего с момента появления последнего общего предка для аллелей в диплоидном полногеноме. последовательность.Мы применили этот метод к нашим пяти геномам медведей с глубоким охватом: PB, двум бурым медведям ABC, бурому медведю, не относящемуся к ABC, и черному медведю, в дополнение ко второму PB с более низким охватом (приложение SI, приложение , рис. . S14 и S15).

Бурые медведи демонстрируют примерно схожие тенденции в их предполагаемой истории N _e за последние ∼5 миллионов лет (рис. 6 A ), отражая геологические эпохи плейстоцена и плиоцена. В частности, следует отметить, что продолжительное снижение N _e начинается к концу раннего плейстоцена (∼1 млн лет назад), когда преобладающая длина волны климатических циклов сменилась с 41 тысячелетия на 100 тысяч лет и глобальные оледенения. климат стал намного более суровым (26).Напротив, черный медведь N _e , который начал сокращаться раньше, чем у бурого медведя, стабилизируется и восстанавливается в течение этого времени, что свидетельствует о меньшем воздействии похолодания и высыхания среднего плейстоцена на этот вид, возможно, из-за палеогеографических условий в более низких широтах. диапазон. Бурый медведь N _e восстанавливается позже, достигая пика примерно в 140 тыс. Лет назад (рис. 6 B ), что примерно коррелирует с повышенными температурами последнего межледниковья (Eemian; 130–114 тыс. Лет назад).Резкое снижение N _e следует за тем, как Земля испытала общее похолодание во время последнего оледенения.

Медведь демографическая история. ( A ) PSMC (25) оценки истории медведя N _e , выведенные на основе четырех геномов медведя, показаны на временном интервале в 5 миллионов лет (здесь показан только один из бурых медведей ABC; SI Приложение , Рис. S14, показывает результаты для всех проанализированных геномов, а также результаты повторной выборки начальной загрузки). Пунктирная рамка указывает промежуток времени, более подробно показанный в B .Большой заштрихованный прямоугольник иллюстрирует ранний плейстоцен, тогда как меньшие серые области относятся к ключевым геологическим событиям, более подробно показанным в B и обсуждаемым в тексте. ( B ) Большая заштрихованная серым область ( справа ) относится к раннему плейстоцену, а другие серые области (справа налево) относятся к межледниковым стадиям морских изотопов (MIS) 15, 13 и 11. , и эемский соответственно. Стрелки указывают на основные события в истории популяции медведей, обсуждаемые в тексте.H, эпоха голоцена.

Исторические тенденции в PB N _e показывают совершенно иную картину в течение плейстоцена. Во-первых, наши результаты показывают, что популяция ПБ Баренцева моря объединилась не менее 1 млн лет назад (Рис. 6 A ). Хотя это время контрастирует с гораздо более поздней оценкой происхождения PB, основанной на митохондриальных геномах (160–150 тыс. Лет назад; SI Приложение , рис. S5), это не противоречит результатам, полученным из расширенной скрытой марковской модели, описанной ранее.Что касается PSMC, заметное увеличение N _e между 800 и 600 тыс. Лет назад (рис. 6 B ), возможно, чему способствовало похолодание среднего плейстоцена, приблизительно ограничено этапом 11 морского изотопа (420–360 тыс. Лет назад), т.е. самый длинный и, возможно, самый теплый межледниковый интервал за последние 500 000 лет и потенциальный аналог для текущего и будущего климата (27). Хотя PB N _e после этого остается на низком уровне, небольшое восстановление примерно совпадает с разделением материнской линии ABC медведь – PB ( SI Приложение , рис.S5) может быть связано с пост-эемским похолоданием, хотя это также может указывать на увеличение структуры населения (25). Недавнее небольшое увеличение N _e во время голоцена могло отражать похолодание во время последнего ледникового максимума, хотя известно, что геномные сигнатуры таких недавних событий имеют меньшую силу (25). В целом, этот анализ убедительно свидетельствует о том, что хотя PB N _e мог быть значительно больше в прошлом, он, похоже, испытал длительное и резкое снижение за последние 500000 лет, будучи значительно меньше бурого медведя N _e , и, возможно, объясняет наблюдаемое более низкое генетическое разнообразие PB по сравнению с бурыми медведями.Взятые вместе, наши результаты убедительно показывают, что ключевые климатические события сыграли важную формирующую роль в эффективном размере популяции медведей.

Адаптация растений к окружающей среде Арктики: потенциальные сигналы положительного отбора.

Глубоко секвенированные геномы также позволяют нам начать исследовать уникальные характеристики PB и то, как это может отражать его превосходную адаптацию к экстремальным условиям Арктики. PB демонстрирует обширную адаптацию к жизни в Арктике.К ним относятся механизмы, которые позволяют им поддерживать гомеостаз при низких температурах, и простираются от очевидных морфологических особенностей до более тонких физиологических характеристик (28), таких как толстый слой телесного жира, почти полное покрытие бесцветным мехом, который обеспечивает камуфляж для охота на льду и черная кожа, способная поглощать тепло солнца (29). Более того, хотя характерная для них схема расходования энергии и накопления жира характерна для бурых и черных медведей, физиологические состояния у них довольно динамичны, и только беременные самки проходят длительное зимнее выгул (30).

Мы использовали несколько подходов для поиска признаков генетической основы, связанной с фенотипическими различиями между бурыми медведями и PB. Во-первых, мы определили области генома, которые потенциально могут нести гены и / или другие функциональные элементы при положительном отборе в одной или обеих линиях (31). Мы использовали значение F _ST для каждого SNP, чтобы измерить разницу в частотах аллелей между PB и бурыми медведями, и исследовали геномные интервалы (относительно сборки собаки), при которых геномы двух видов отличаются более, чем могли бы. объясняется случайностью ( P ≤ 0.01), на что указывает метод рандомизации ( SI Приложение ). Мы выявили 1374 таких интервала средней длиной 20 943 п.н. Гены (с аннотациями в геноме собаки) в самых высоких интервалах оценки ( SI Приложение , таблица S8) включают DAG1 (дистрогликан), который является центральным компонентом гликопротеинового комплекса, ассоциированного с дистрофином скелетных мышц, и ген-кандидат, который в мутантной форме участвует в мышечной дистрофии (32). Спящие черные медведи теряют значительную мышечную силу, хотя они сохраняют значительно большую мышечную силу, чем люди и грызуны, в течение того же периода бездействия (33).Возможно, что DAG1 обеспечивает PBs механизмом для уменьшения мышечной атрофии, возможно, в сочетании с рециркуляцией мочевины и консервацией белка (34).

Другой интервал с высокими показателями содержит ген BTN1A1 (рис. 7), который высоко экспрессируется в секреторном эпителии молочной железы во время лактации и необходим для регулируемой секреции капель липидов молока (35). Предыдущие эксперименты показали, что определенные полиморфизмы в BTN1A1 значительно увеличивают содержание жира в молоке крупного рогатого скота и коз, тогда как его делеция, как было обнаружено, сильно влияет на выживаемость и вес мышей при отъеме (35, 36).Мы предполагаем, что мутации (возможно, некодирующие), приводящие к большей экспрессии этого гена или активности его белкового продукта, могут приводить к более высокому содержанию жира в молоке PB. Это может быть адаптацией PB для увеличения поглощения липидов медвежатами по сравнению с бурыми медведями.

Возможная область селективной развертки в ПБ. Вверху : положение пяти коротких интервалов высоких значений F _ST между PB и бурыми медведями, которые отображаются на хромосоме 35 собаки. -широкий).Эта область содержит несколько генов, включая гомолог BTN1A1 , который может быть связан с захватом липидов детенышами (как подробно описано в тексте). Для 76 SNP мы строим график F _ST , причем расстояния больше 0,8 показаны синим цветом (т.е. менее похожи на бурых медведей) и менее 0,8 – красным (т.е. более похожи на бурых медведей). Интервалы оценивали путем вычитания 0,8 из F _ST и суммирования по всем SNP в интервале. По всему геному только 17,1% SNP имеют положительную оценку, и высокая плотность SNP с большим F _ST в этой области является статистически значимой ( SI Приложение ).

Аминокислотный полиморфизм.

Мы также провели поиск вариантов аминокислот в генах PB, потенциально связанных с фенотипическими адаптациями ( SI Приложение , Таблица S9 и Рис. S16) и классифицированных как «повреждающие» согласно расчетам ( SI Приложение , Рис. S17) ). Хотя точная функция этих генов в PBs явно нуждается в дальнейшем исследовании, мы идентифицировали замены в предполагаемых ортологах, возможно, связанных с метаболизмом жирных кислот, гибернацией и пигментацией (более подробная информация представлена ​​в приложении SI ). Например, мы нашли вариант ортолога FTO , который, по-видимому, зафиксирован в PB. Мутации в этом гене ранее коррелировали с тяжелым ожирением у людей и задержкой послеродового роста, безжировой массой тела и гиперфагией у мышей (37). Мы также обнаружили явно фиксированный и повреждающий вариант ортолога PLTP , белковый продукт которого участвует в синтезе и катаболизме липопротеинов высокой плотности (38) и может влиять на доступность триглицеридов и увеличение веса во время гиперфагии. в ПБ.Кроме того, мы обнаружили фиксированные варианты у двух предполагаемых ортологов, участвующих в синтезе и катаболизме длинноцепочечных жирных кислот: CPT1B и ACSL6 (39, 40). Фиксированные варианты в этих генах могут быть связаны с профилем жирных кислот PB.

Кроме того, мы искали полиморфизм аминокислот в генах, ранее связанных с пигментацией кожи и волос ( SI Приложение , Таблица S13). Мех PB состоит из двух слоев: плотного подшерстка и длинных остевых волос, не содержащих пигментов, с полой сердцевиной. EDNRB был единственным геном, связанным с пигментацией, который представлял фиксированный вариант в PB. Этот ген необходим для миграции меланобластов в дерме и кишечных нейробластах, и его мутации приводят к различным цветовым узорам (41). Варианты, которые отделяют черного медведя от других изученных медвежьих, были обнаружены в генах MC1R , OCA2 , TYRP1 и DCT , взаимодействие которых определяет характер окраски шерсти у мышей, лошадей и собак (42 ).Было обнаружено, что SNP в локусе MC1R вызывает рецессивного бело-фазового (т. Е. Kermode) черного медведя, обнаруженного на северо-западном побережье Британской Колумбии (43). Среди различных изученных медведей мы также обнаружили интересный набор из девяти аминокислотных полиморфизмов в гомологе TRPM1 ( MLSN1 ). Этот ген отвечает за различную окраску шерсти у лошадей Аппалуза (44). Большое количество обнаруженных вариантов является необычным и может отражать сохраняющиеся дублирующиеся гены (особенно у бурых медведей, у которых преобладали полиморфизмы и могли быть связаны с их политипическим окрасом шерсти). Мы предполагаем, что комбинированные эффекты EDNRB и TRMP1 могут быть вовлечены в пигментацию кожи PB, при этом отсутствие пигментации волос, возможно, вызвано нарушенной миграцией меланобластов к стержням волос из-за их полой анатомии.

Выводы

Гибридизация – широко распространенное эволюционное явление, которое может играть роль в видообразовании, особенно среди близкородственных видов. Сегодня мы знаем, что эволюционное развитие может продолжаться даже тогда, когда виды подвергаются «геномным вторжениям» со стороны других видов (45).У растений это явление хорошо известно и часто связано с дупликацией всего генома (т. Е. С аллополиплоидным видообразованием). Вполне возможно, что скрещивание и интрогрессия были важными факторами во время эволюции многих видов млекопитающих, вероятно, связанных с сокращением и расширением ареала во время климатических колебаний. Например, эволюция человека могла быть тесно связана с изменением климата, во время которого выживание в убежищах и дифференцированная экологическая адаптация могли сформировать дивергенцию ранних человеческих видов (46). Точно так же межстадиальная миграция и экспансия, возможно, вынесли людей современного анатомического вида из Африки и вступили в контакт с неандертальцами сокращенного ареала и привели к скрещиванию между двумя линиями гомининов (46).

Из-за изменившейся арктической окружающей среды, которая испытала на себе самые сильные последствия глобального изменения климата за последние десятилетия (47), ПБ и ее неопределенный долгосрочный статус стали центром дискуссий о влиянии глобального изменения климата на биоразнообразие (48, 49).Хотя наши результаты ясно демонстрируют, что американские черные медведи, бурые медведи и PB имели в значительной степени независимую эволюционную историю на протяжении миллионов лет, оставляя отпечатки в ядерном геноме PB, вероятно, связанные с экологической адаптацией к арктической среде, мы также показываем, что поток генов между Виды медведей, возможно, в результате сдвигов в распределении ранее изолированных популяций, произошли в течение их эволюционной истории. Поскольку этот поток генов, по-видимому, оставил противоречивые отпечатки в разных частях геномов медведей, как было обнаружено с помощью скрытого марковского анализа слияния и карт примесей, время дивергенции может существенно различаться по геному (50), что частично может объяснить разные оценки времени дивергенции. сообщается о событиях видообразования PB (e.г., исх. 9). Поскольку поток генов между американским черным медведем и бурым медведем был достаточно заметным, но неожиданно для того, чтобы оставить четкую подпись в их геномах сегодня, древняя примесь в ответ на изменение климата может оказаться более общим явлением в мире. линия медвежьих в целом. Однако текущая тенденция к потеплению климата в Арктике вызвала резкое отступление морского льда, возможно, с невиданными ранее темпами (51). Если эта тенденция сохранится, возможно, что будущие ПБ на большей части своего ареала будут вынуждены проводить все больше времени на суше, возможно, даже во время сезона размножения, и поэтому будут чаще контактировать с бурыми медведями. Недавно дикие гибриды и даже потомство второго поколения были зарегистрированы в северной части моря Бофорта арктической Канады, где ареалы бурых медведей и PB, по-видимому, перекрываются, возможно, как недавняя реакция на климатические изменения. Подобное скрещивание с другими арктическими видами может иметь большое влияние на полярное биоразнообразие в целом (52). Возможно, даже более драматично, мы показываем, что продолжительное снижение PB N _e произошло в течение последних примерно 500000 лет, возможно, за ним последовало недавнее расширение небольших популяций основателей, которые могли выжить в рефугиумах во время межледниковья.Одна из таких «выживших популяций» может быть представлена ​​нашим образцом ПБ возрастом от 130 000 до 110 000 лет, что позволяет предположить, что Свальбард, возможно, представлял собой важный рефугиум во время прошлых межледниковья, выступая в качестве исходной популяции для расширения ареала в последующие более прохладные периоды. Если современные популяции PB являются результатом расширения диапазона голоцена из нескольких небольших сокращенных популяций в средне-позднеплейстоценовых рефугиумах, это может объяснить наблюдаемое низкое генетическое разнообразие в PB сегодня и, возможно, сделать современные популяции PB еще более уязвимыми к будущим климатическим и другим условиям окружающей среды. беспорядки.

Многие вопросы, касающиеся эволюции PB и его близких родственников, все еще остаются, и будущие палеогеномные и расширенные популяционные геномные подходы, несомненно, прольют дополнительный свет на некоторые из этих вопросов. До настоящего времени были доступны лишь ограниченные генетические ресурсы для исследования вопросов дивергенции и адаптации медведей, но здесь мы разработали и проанализировали обширные данные о геномных и транскриптомных последовательностях трех разных видов. Таким образом, ресурсы и результаты, представленные здесь, важны для лучшего понимания прошлых реакций во время истории эволюции медведя, что может дать информацию для прогнозов текущих и будущих реакций. Помимо того, что наша сборка стала доступной, мы разместили наши вызовы SNP на веб-сервере Galaxy (usegalaxy.org) и предоставили набор инструментов для их анализа, который можно запускать через простой интерфейс, для которого требуется только интернет-браузер. Например, анализ PCA, примеси и выборочного анализа проводился с помощью команд Galaxy, и мы предоставляем рабочие процессы Galaxy, в которых все параметры и параметры команд, используемые в нашем анализе, указаны явно.

Материалы и методы

Подробная информация об отборе проб и экспериментальных процедурах представлена ​​в Приложении SI .

Секвенирование генома.

Для секвенирования геномной ДНК были взяты образцы крови и тканей одного американского черного медведя ( U. americanus ), одного бурого медведя ( U. arctos ) с полуострова Кенай, двух бурых медведей с архипелага Александра на Аляске (т.е. , Бурые медведи ABC), пять PBs ( U. maritimus ) с Аляски (популяции Чукотского моря и южной части моря Бофорта) и 18 PBs со Свальбарда (популяция Баренцева моря). За исключением одного образца крови бурого медведя ABC (ABC2), который был взят у спасенного детеныша в реабилитационном центре в Ситке, штат AK, все образцы были взяты из диких популяций с использованием стандартных процедур и с соответствующими разрешениями.Все образцы секвенировали для генерирования считываний парных концов со средней длиной 101 п.н. с использованием платформы секвенирования Illumina HiSeq 2000. Образец PB7 был секвенирован до большей глубины охвата с использованием нескольких библиотек парных концов с размерами диапазона 160, 180 и 300 пар оснований, в дополнение к библиотеке пар спариваний размером 3 kb ( SI Приложение , таблица S1).

Геномные сборки и идентификация SNP.

Короткие чтения Illumina и чтения с парных концов из библиотек коротких вставок были собраны в контиги для PB7 с использованием SOAPdenovo (12).Затем все доступные данные о последовательностях были сопоставлены с этими контигами с использованием информации о парах спаривания в порядке предполагаемого размера вставки (от 160 до 3 т. п.н.) для создания каркасов. За созданием каркаса следовала локальная повторная сборка последовательностей в промежутках внутри каркаса. Чтобы оценить точность последовательности черновиков, мы выровняли все показания парных концов из PB7 обратно в сборку с помощью выравнивания Барроуза-Уиллера (BWA) (53). Митохондриальные чтения были сопоставлены с эталонной последовательностью (номер доступа в GenBank.NC003428) с помощью BWA с параметрами по умолчанию или, в случае черного медведя, с помощью LASTZ (54). Эти выравнивания были введены в базирующийся на ссылках ассемблер для сборки мтДНК образца черного медведя и BWA для сборки мтДНК для оставшихся образцов. Идентификация ядерных SNP, согласованных как с нашим проектом сборки, так и с геномом собаки (сборка C. ownis , версия 2.0), и идентификация митохондриальных SNP описаны в приложении SI .

Секвенирование транскриптомов.

Транскриптомы двух особей медведя, PB и бурого медведя, были секвенированы на секвенаторе Personal Genome Machine, что дало в общей сложности 9 миллионов считываний с предполагаемой средней длиной 190 оснований. Используя программное обеспечение Genome Sequencer Reference Mapper (Newbler, версия 2.6), замаскированные считывания от каждого медведя были сопоставлены с нашей сборкой PB, а также с последовательностями кДНК 22 291 собаки ( C. familis ) (мРНК; SI, приложение , таблица S2 и рис. S3).

Генотипирование SNP.

Из SNP, обнаруженных путем секвенирования генома 23 современных PB, был идентифицирован набор из 100 высококачественных аутосомных SNP на основе критериев, согласно которым локусы будут вариабельными среди 23 PB и что оба аллеля в каждом локусе однозначны в древний PB (праймеры перечислены в приложении SI, таблица S6). Из всего 118 современных белых и бурых медведей (рис. 5 и SI Приложение , таблица S5) мы провели мультиплексную ПЦР-амплификацию локусов SNP. Для каждого продукта мультиплексной ПЦР готовили библиотеки Illumina TruSeq со штрих-кодом.Двадцать четыре библиотеки были объединены в эквимолярных количествах и секвенированы за один прогон на платформе Illumina MiSeq.

Аналитические процедуры.

Филогенетический анализ данных SNP ядерного генома, расчеты оценок примесей, а также поиск геномных интервалов, на которые может повлиять выборочное сканирование, проводились с использованием инструментов, доступных в Galaxy (usegalaxy.org). Начальный анализ ядерных данных SNP не увенчался успехом из-за вычислительных ограничений, налагаемых необходимым количеством массивных наборов псевдорепликационных данных.Филогенетический анализ митохондриального генома проводился с использованием метода максимального правдоподобия и байесовского вывода, а оценки дат молекулярной дивергенции были рассчитаны с использованием программного обеспечения BEAST (55). Анализы положительной селекции проводили с помощью программы TreeSAAP (56). Анализ генетического разнообразия и дифференциации среди образцов, амплифицированных для выбранных локусов SNP, был выполнен в GenALEx 6.41 (57). Программа Байесовской кластеризации Structure версии 2.3.3 (58) использовалась для исследования присутствия примеси между бурыми медведями и PB, а также для исследования структуры популяции внутри PB. Чтобы проанализировать демографическую историю медведя, мы применили скрытую марковскую модель слияния к четырем нашим геномам медведя с большим охватом: PB (PB7), одному бурому медведю ABC (ABC1), бурому медведю, не относящемуся к ABC (например, GRZ), и черный медведь. Чтобы получить подробную историю размеров предковой популяции, мы реализовали PSMC (25) для анализа вышеупомянутых четырех геномов в дополнение ко второму бурому медведю ABC (ABC2) и второму PB с меньшим охватом (PB3).

Аминокислотный полиморфизм.

Среди обнаруженных нами SNP мы провели поиск SNP, которые можно проследить до предполагаемых генов-ортологов, известных из генома собаки (canFam2), что привело к появлению SAP.Функциональный эффект каждого SAP был предсказан с помощью PolyPhen 2 (59), который обеспечивает классификацию «возможно повреждающий», «возможно повреждающий» или «доброкачественный». Используя те SAP, которые классифицируются как повреждающие (то есть, возможно, повреждающие и, возможно, повреждающие), мы ранжировали набор путей KEGG на основе трех различных показателей: процент пораженных генов, изменение количества путей и изменение длины путей.